β-葡萄糖苷酶的生物信息学分析、分子改造及固定化研究

发布时间：2020-01-22 20:15

【摘要】：β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)是一种纤维素酶,它可以在纤维素的代谢反应中起作用,将纤维二糖分解为更容易被利用的葡萄糖,它还可以将水果和茶叶中的香气前体物质进行酶解,从而起到增香的作用。β-葡萄糖苷酶在食品、日用化工、可再生资源等领域都具有重要的应用价值。但是在实际应用中还是有许多不足,例如酶成本不够低廉,在工业应用中,酶不能很好的适应工业环境,稳定性不够好等,这些因素都会限制β-葡萄糖苷酶的应用。因此,对β-葡萄糖苷酶进行改造具有十分重要的意义。本研究对来源于Thermobifida fusca的β-葡萄糖苷酶基因进行了克隆,成功构建了mEsprit-Bglc-His质粒,并对其表达的β-葡萄糖苷酶进行了一些理化性质的研究。试验结果表明,其相对分子质量约为55 kDa,反应时最适温度是60℃,最适缓冲液pH是7.0,最适反应时间是30 min,对底物p-NPG的米氏常数Km为0.19 mmol/L。该酶的温度稳定性、pH稳定性以及储存稳定性都欠佳,因此,本研究对其进行了生物信息学的预测和分析,试图找到提高稳定性的办法。通过同源比对找到了它的保守区序列,选取4个不同来源的β-葡萄糖苷酶对两个保守区之间的序列进行了二级和三级结构的分析,结果表明,这一段序列的α-螺旋含量各不相同,脯氨酸数量和位置也各不相同,对这一段序列进行替换很有可能引入更高含量的α-螺旋和脯氨酸,进而提高稳定性。本研究对这两个保守区之间的序列构建土壤宏基因组区段库,将来源于T.fusca的β-葡萄糖苷酶基因的这一小段序列,替换成来源于土壤中其他菌β-葡萄糖苷酶基因的序列,从而构建出许多新的β-葡萄糖苷酶基因。尽管通过筛选,没有获得有应用价值的新的β-葡萄糖苷酶基因,但本研究为高效开发利用微生物基因资源提供了新的思路和方法,对相关领域的研究也有重要的参考价值。为了进一步改善酶学性质,本研究还用癸二酸包覆的磁性纳米颗粒对其进行了固定化,同时对其进行了一些酶学性质的研究,并与游离的β-葡萄糖苷酶进行了比较。试验结果表明,反应的最适pH值为7.0,最适温度为40℃,与游离酶相比,最适温度降低,发生了偏移。固定后的酶,循环使用10次剩余活性仍然在60%以上,对底物p-NPG的米氏常数Km为0.28 mmol/L,与游离酶km值相比略增加了一点。本研究用癸二酸包覆的磁性纳米颗粒对其进行的固定化,提高了β-葡萄糖苷酶的一些方面的稳定性,包括温度、pH、有机溶剂、涡旋、超声以及储存稳定性等,这将大大提高β-葡萄糖苷酶的应用范围,使其更适合应用于工业。另外本研究还利用固定化β-葡萄糖苷酶重复分解天然底物稻壳粉和玉米芯粉,这对合理利用纤维素有一定的实际应用价值。
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q814.2;Q78

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本文编号：2572056