家蚕丝腺转录因子SGF1核定位的调控机制研究

发布时间：2020-01-23 21:07

【摘要】：家蚕(Bombyx mori)因其丝腺能够合成蚕丝而成为重要的经济昆虫,也作为鳞翅目昆虫的典型代表而成为变态和发育生物学研究的模式昆虫。后部丝腺(PSG)负责分泌合成丝素蛋白,而丝素蛋白是蚕丝蛋白的主效成分,直接决定着蚕丝蛋白的质量和产量。对家蚕丝素蛋白合成调控机制的阐明,将为今后蚕业分子育种提供重要的理论参考。家蚕丝腺转录因子SGF1(Silk Gland Factor 1)属于FOXA转录因子家族,是家蚕中首个被报道参与调控丝素蛋白转录的重要因子。合作实验室前期研究发现,Ras1cA转基因家蚕后部丝腺中SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的磷酸化水平升高,推测磷酸化升高的SGF1与转基因家蚕蚕丝产量升高相关,而SGF1磷酸化水平变化如何影响其对丝素蛋白相关基因的转录调控,且在该过程中如何受到Ras1下游Raf/MAPK或PI3K/AKT信号通路的调控,还有待探究。本研究运用生物信息软件对家蚕SGF1基因进行分析,并对SGF1肽段(EQEAAS*PTSALQR)的位点和调控的激酶进行预测;对制备的SGF1全长和磷酸化抗体进行体外验证和体内的PSG发育表达谱分析;运用Western blot和免疫荧光染色方法在体内初步明确SGF1的核定位与其调控丝素蛋白基因的功能呈正相关;利用Raf/MAPK或PI3K/AKT信号通路抑制剂对虫体进行处理以明确哪条信号通路对SGF1核定位起到主要作用;最终在家蚕和哺乳动物细胞系中进一步研究了 Raf/MAPK或PI3K/AKT抑制剂对SGF1和SGF1同源基因FoxA1核定位的影响是否通过磷酸化调控的方式实现。主要内容和结果如下:1.全长和磷酸化SGF1抗体的验证及SGF1在家蚕后部丝腺中的表达谱分析根据已知的SGF1全长和磷酸化肽段序列信息,制备全长和磷酸化抗体。构建pIEx4-SGF1-V5和pIEx4-SGF1s91A-V5两种质粒,在家蚕BmN细胞系中转染并进行Western Blot验证。随后,对家蚕后部丝腺SGF1基因时空表达模式进行分析,发现从4龄第4天(4L4D)开始一直到5龄第3天(5L3D),SGF1的转录水平逐渐增加,随后开始逐渐降低,对家蚕后部丝腺SGF1蛋白表达模式进行分析,发现从4龄第4天(4L4D)开始一直到5龄第7天(5L7D),其蛋白表达水平逐渐增加,而从5L7D开始,其蛋白表达水平迅速下降。2.家蚕体内SGF1的核定位与其丝素蛋白表达调控的相关性分析利用免疫荧光染色方法对SGF1在家蚕后部丝腺不同发育阶段的定位进行检测,结果表明在家蚕摄食期,SGF1普遍存在核定位现象。即在预蛹1天(PP1)之前SGF1 一直位于细胞核内,而在预蛹2天(PP2)时SGF1位于细胞核外,因此从PP1到PP2的过程中SGF1核定位发生改变,即由原来SGF1聚集在核内变化为弥散在核外。进一步实验以确证SGF1出核的时间窗口,发现其具体出核时间为上簇36h(W36h)。利用免疫荧光染色方法和Western Blot比较W36h时期Ras1CA转基因家蚕和野生型家蚕中SGF1定位和表达,发现与野生型家蚕相比,转基因家蚕的SGF1依旧定位在细胞核中且蛋白表达量较高。3.体内研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路对SGF1核定位的影响为分析Ras下游Raf/MAPK或PI3K/AKT通路如何影响SGF1的表达和定位。本研究采用Raf/MAPK抑制剂为PLX和PD60,PI3K/AKT/TORC1的抑制剂为Wort、Rapa和LY294。在家蚕虫体水平进行抑制剂处理,经免疫组织化学染色实验和Western Blot实验结果表明,处理后的SGF1表达量减少并且不在核内,因此说明这两种信号通路参与调控其核定位过程。4.体外研究Raf/MAPK或PI3K/AKT通路对SGF1核定位的影响在BrnN细胞中通过抑制剂处理和点突变实验进一步验证Raf/MAPK或PI3K/AKT通路通过调控SGF1 Ser91位点影响其核定位功能。为明晰该调控机制是否存在进化上的保守性,构建SGF1的同源基因FoxA1的野生型和点突变载体,利用免疫组织化学染色实验和Western Blot研究FoxA1的可能磷酸化位点以及所受信号通路调控,结果发现FoxA1磷酸化位点与核定位无关,但其核定位功能受Raf/MAPK信号通路调控。综上所述,家蚕后部丝腺中的SGF1核定位受到Raf/MAPK和PI3K/AKT/TORC1信号通路的调控,且与SGF1对丝素蛋白合成调控正相关。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q963

【参考文献】