YajQ家族c-di-GMP受体蛋白XC3703、Smlt4090及根癌农杆菌T6SS衔接蛋白Atu4349结构及功能的

发布时间：2020-07-07 23:28

【摘要】：野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是引起十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc能够在世界范围内感染十字花科植物,从而在种植此类作物的地区造成重大经济损失。嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)是一种较为罕见的革兰氏阴性条件致病菌,易引起免疫力低下个体出现感染症状。c-di-GMP是一种广为人知的胞内第二信使,参与细菌包括生物被膜合成、细菌毒力、细胞运动等多种重要生理功能。而c-di-GMP的功能是通过细胞内存在的c-di-GMP受体实现的。c-di-GMP通过与受体相互作用而引起下游相应生理生化功能变化从而行使其功能。近期有研究报道YajQ蛋白家族成员中存在一种新型的c-di-GMP受体。YajQ家族蛋白质二级结构在细菌中相对保守,具有潜在的与核酸结合的能力。而Xcc中的YajQ家族成员XC3703被证明能与转录因子XC2801发生相互作用,而其与c-di-GMP的结合能够逆转这种相互作用,从而影响下游基因的表达,影响包括生物被膜形成、细菌毒力等在内的多种重要生物学功能。而S.maltophilia中的同家族成员Smlt4090被证明也有结合c-di-GMP的能力,该蛋白的突变菌株生物被膜形成量及对侵染对象的吸附性明显降低。在本论文的第一部分中,主要内容为XC3703及Smlt4090结构与功能的研究。XC3703及Smlt4090氨基酸序列比对相似度高达83%。在此论文中,我们成功解析得到了 XC3703及Smlt4090的蛋白质结构,但是遗憾的是并未获得二者与c-di-GMP形成的复合物的蛋白质结构。在解析获得的蛋白质结构中,XC3703每个不对称单位中包含两个蛋白质分子,但随后的分析柱实验证明其在溶液状态中以单体形式存在。而在Smlt4090结构中,每个不对称单位中包含三个蛋白质分子,分析柱实验同样证明其在溶液状态中以单体形式存在。另外,结构比对结果显示,二者结构相似度高达81%,根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是引发植物冠瘿病的病原菌,能够使植物形成冠瘿瘤。另外,由于该菌基因组中的Ti质粒,其在植物遗传操作中有重要应用。细菌六型分泌系统(Type Ⅳ secretion system,T6SS)是近年来备受关注的一种细菌分泌系统。T6SS是一种功能与结构上皆类似于倒置的噬菌体尾部的注射器状分泌装置,能够通过将多种效应蛋白注射至相邻原核或真核细胞中取得竞争或生存优势。而近期的实验证明,效应蛋白的有效输出需要同宗衔接蛋白的参与。衔接蛋白能与相应效应蛋白及注射装置组成部分VgrG蛋白形成复合物,从而帮助效应蛋白分泌。衔接蛋白基因敲除后细菌毒力明显下降。在本论文的第二部分中,主要内容为根癌土壤杆菌中衔接蛋白Tap-1蛋白质纯化及结晶条件的研究。在实际实验中发现,使用大肠杆菌BL21细胞表达得到的Tap-1蛋白无法得到蛋白晶体。考虑到Tap-1中有三个半胱氨酸,晶体生长可能受二硫键影响。因此在实验中除片段截取外还尝试了其他的三种方法:一为在氧化型菌株大肠杆菌TransB菌株中表达蛋白,帮助二硫键正确形成;二为在纯化过程中添加还原剂DTT防止二硫键形成;三为对蛋白质进行限制性酶切,截取核心部分进行晶体生长。方法一、二均得到蛋白晶体,晶体外观较好,但衍射质量尚达不到解析要求,需进行后续实验进一步研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S432.4

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