基于转录组学方法研究微囊藻毒素致白鲢肝损伤的作用机制

发布时间：2020-07-08 06:18

【摘要】：蓝藻毒素MC-LR可对人和动物产生生物毒性,近年来为毒理学研究者所关注。但MC-LR的肝毒性机制尚不完全清楚,特别是对白鲢肝损伤机制鲜有报道。本实验采用第二代转录组测序方法,较为全面系统地解析MC-LR暴露导致白鲢肝毒性的分子机制,为全面和深入理解MC-LR对鱼类肝毒性的机制提供理论支撑。本实验以白鲢为实验动物,通过改良寇氏法获得MC-LR对白鲢急性毒性的24 h半致死剂量LD_(50)(544μg/kg)。依据所获得的LD_(50),选定高浓度组(200μg/kg)、低浓度组(50μg/kg)及对照组(8.6%生理盐水)对白鲢进行腹腔注射急性染毒实验。通过提取处理组和对照组的白鲢肝脏总RNA,应用Illumina Hiseq 4000平台进行转录组测序,采用无参考序列的De novo组装,处理组和对照组共产生了超过20 Gb的数据。本实验分别对转录组数据进行差异表达基因的筛选、GO功能分析、KEGG pathway分析,并对差异表达基因进行了qPCR验证,获得以下几个方面的实验结果。1.De novo测序结果腹腔注射50μg/kg和200μg/kg MC-LR处理组和对照组分别获得转录本的总长度为54 217 023 bp、66 980 128 bp、53 611 308 bp;平均长度分别为779 bp、830 bp、790 bp;长度多集中在200-400 bp,以300 bp长度为主,说明样品片段断裂随机性强,符合组装要求。转录本组装后共得到Unigene数目分别为50 116个、58 987个、49 383个。将这些转录本使用Trinity组装后得到的Unigene,采用了RPKM方法计算各个基因表达量。根据统计学差异标准,结果发现,50μg/kg MC-LR处理组与对照组相比共有上调基因2 565个、下调1 831个;200μg/kg MC-LR处理组与对照组相比共有上调基因7 256个、下调4 751个。2.差异表达基因的GO功能分析将差异表达基因逐一在GO数据库进行比对分析,注释比对基因的功能以及参与的生物过程。分析结果发现,GO重叠群分布在斑马鱼和草鱼之间。在GO数据库共注释了14 268个差异表达基因,覆盖率分别为20.67%。MC-LR暴露后在白鲢肝脏中差异表达基因主要富集在细胞器、核质、细胞膜、大分子复合物、细胞连接等部分,可能影响受体活性、蛋白结合转录因子活性、核酸结合转录因子活性、分子转导活性、酶调节剂活性、氧化还原过程、有机酸代谢、有机氮化合物代谢、辅酶因子代谢、DNA损伤修复等过程。主要参与应激反应、生殖发育、生物调节、氧化还原、代谢过程、激素分泌、免疫系统、细胞组分组织或生物发生、细胞聚集、细胞粘附等过程。3.差异表达基因的KEGG pathway分析分析结果显示,在KEGG数据库中对比到31 890个Unigene,覆盖率46.19%。通过差异表达基因在KEGG pathway富集发现,MC-LR毒性作用机制可能涉及到NF-κB信号通路、p53信号通路、磷脂酰肌醇3信号通路、Wnt信号通路等。4.qPCR验证主要的差异表达基因根据差异基因表达量、GO分析以及KEGG pathway分析结果,对筛选到的主要差异表达基因进行荧光定量PCR验证。结果显示MC-LR处理组中Raf1、CDC42/RAS、ERK、c-jun、c-myc、p53、S6K1/2、SOS、PTEN、AKT、IKKα、IKKβ、caspase-8、bax、p21、SHP、RAC、PP2A基因表达上调,与转录组预测结果一致。本实验通过转录组学方法较为全面地解析了MCs对白鲢肝毒性作用的主要分子机制,发现了一些与MCs肝毒性相关新的信号通路。该实验结果不仅有助于发现鱼类肝病防治的药物靶点,同时也为人类肝炎、肝癌预防和寻找MCs肝毒性新的分子标记物提供重要的理论支撑。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X52;X171.5;S943
【图文】：

微囊藻毒素,化学结构式

1.2.1 MCs 的结构在结构上，MCs 属于环七肽类的小分子，分子量在 800 到 1 100 Da 之间, 要在肝脏中富集而被公认为非核糖体肝毒素。微囊藻毒素的一般结构中包含7个氨具有 2 个末端氨基酸。目前统计共有 100 多种亚型，其中毒性最强的当属微囊藻毒(Microcystin-LR, MC-LR)，常见的主要有 MC-LR、微囊藻毒素-RR (MicrocysMC-RR ) 和微囊藻毒素-YR (Microcystin-YR, MC-YR) 3 类[27]，其亚型由位于 R1可变氨基酸变化而产生（如图 1-1 ）。大多数同类物的通式结构为（D-alanine1-X2-D-MeAsp3-Z4 -Adda5-D-glutamate6-Mdha7），其中最具特殊性的Adda (3-amino-9-methoxy-2, 4, 6-trimethyl -10- phenyldeca -4, 6- dienoic acid)，被MCs 产生毒性表达所必需的氨基酸[28]。一旦切断 Adda 肽环侧链，便不能抑制子蛋白磷酸酶的活性，即微囊藻毒性失活[29]；且有研究指出通式结构中 D-glutam基酸在微囊藻毒素的肝毒性中可能起着非常重要的作用[30]。

流程图,测序技术,流程,转录组

与 12 年铅转录组数据相比[129]，后者的转录组显示更少但更长的转录本。这原因可能是前者是由多个器官的混合文库组成，比肝脏转录物更多的器官特异；另一个原因可能是由于技术相对成熟，测序深度更加理想。对于非模式动物来ovo 测序技术（如图 1-1）能够从头测序，不需要任何基因序列信息即可对某行测序，然后用生物信息学的分析方法对序列进行拼接、组装，从而获得该物组序列图谱。目前尚未报道有关 MC-LR 对白鲢肝毒性的转录组分析，因此本用 De novo 测序技术更好地理解 MC-LR 对白鲢肝脏的毒性机制。

流程图,信息分析,流程图,自定义

图 2-1 信息分析流程图Fig. 2-1 The flow chart of information analysis2.2.4 原始数据的过滤最初获取到的原始数据被称为 Raw reads, 这些数据必须再次经过过滤处理，去掉质量（自定义长度㩳15 个碱基且占该 reads 总体碱基数目的比例㧐20% 的 reads头被污染以及碱基 N 含量过高的 reads（自定义㧐5% 的 reads），才能得到高质量据，称为 Clean reads。将 Clean reads 保存为 FASTQ 格式用于后续操作。使用 Trinity 法对 Clean reads 进行 De novo 组装。Trinity 的方法主要是通过nchworm、Chrysalis 和 Butterfly 三个独立模块按照顺序以此对 Clean reads 进行处表 2-6。

【参考文献】