果蔬有机磷残留农药降解酶菌种的选育及产酶条件的研究

发布时间：2020-08-21 04:43

【摘要】：随着生活水平的提高,食品安全问题日益受到人们的关注,果蔬中农药的残留对人体健康构成威胁,为解决这一问题,可以通过微生物发酵的方法来降解农药。本文主要研究有机磷农药降解菌的筛选、菌株培养基及培养条件优化、有机磷农药降解酶的分离提纯、酶学性质研究及其基因研究。利用96孔板法从长期喷洒农药的耕地土壤中筛选出能高效降解有机磷农药的菌株,并对其进行形态学、生理生化及分子生物学鉴定,结果表明:筛选的菌株为胶红酵母菌(Rhodotorula muciaginosa),命名为RM-DY21,利用紫外分光光度法测定菌株RM-DY21在32 h内对毒死蜱(50mg/L)降解率可达70.04%,在以毒死蜱为唯一碳源的培养基中,RM-DY21生长较好,氧乐果次之,敌百虫中较少,故说明菌株RM-DY21可以广泛降解有机磷农药。为提高Rhodotorula mucilauginosa RM-DY21对有机磷农药的降解率,通过单因素及响应曲面分析,对培养基及培养条件进行优化。实验确定了Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21最优培养基配方为:乳糖20.0g/L,硫酸铵20.0g/L,酵母浸粉10.0g/L,Ca2+、Mg2+、Zn2+的添加量分别为 0.8、0.6、0.8 mg/20mL 发酵液;利用 Design-expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合设计原理分析实验,确定初始pH 5.0,温度30℃,培养36 h时,Rhodotorula mucilotonosa RM-DY21对有机磷农药的降解率可达到83.86%,比优化前提高了 10.62%,为后续菌株产酶研究的相关试验奠定了良好的基础。实验对菌株Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所产有机磷降解酶进行定位,并采用盐析及柱层析的方法对有机磷降解酶进行了分离纯化。实验结果表明,Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21菌株所产生的有机磷降解酶为胞外酶;通过硫酸铵分级沉淀,得到降解酶盐析范围为60%～80%(w/v);透析并浓缩后,用SephadexG-100葡聚糖凝胶进行层析,得到有机磷降解酶的比酶活为350.63 U/mg;再次透析浓缩后,用DEAE SepharoseFastFlow柱层析,0.2～0.5mol/L氯化钠的磷酸盐缓冲液进行洗脱,收集酶液测其比酶活为693.94 U/mg;通过SDS-PAGE变性凝胶电泳确定Rhodotorula mucilaginosa RM-DY21所产的有机磷降解酶分子量约40kDa。酶学性质研究发现,有机磷降解酶的反应温度为30～50℃,其最适反应温度为40℃;保存温度在-20℃下最佳;反应pH为7～9,最适pH为8;最适反应时间为30 min;最适酶添加量为20 μL。不同金属离子对有机磷降解酶的活性有不同的影响,0.2mmol/L的Na+、Zn2+对降解酶有较强的激活作用,而Ca2+、Mg2+的激活作用较弱;同浓度Li+、K+、Mn2+、Ag+对降解酶有较强的抑制作用,而Cu2+、Fe3+、Fe2+抑制作用较弱;异丙醇、丙酮对酶活性有抑制作用,乙醇随着浓度的升高激活作用增加;高浓度的甲醇有微弱提高酶活作用,并测得其动力学参数 Km=24.213 μmol·L-1,Vmax=18.553 μmol·(mg·min)-1。参照GenBank中已收录的有机磷降解酶基因序列,利用VectorNTI 10软件分析并设计了 2对特异性引物,对实验菌株的产有机磷降解酶基因进行PCR扩增测序,并利用相应软件对其氨基酸序列进行分析。测序结果显示,实验菌株的有机磷降解酶基因序列与其他多种菌株的一致性较高,该opd基因含1155个核苷酸,编码384个氨基酸,OPD蛋白的分子式为C1830H2944N530O540S11,分子量约为41363.39 Da,为疏水性稳定蛋白,等电点为9.05,总原子数为5855,存在信号肽,属于分泌型蛋白,二级结构具有0α螺旋(Hh)38.54%,延伸链(Ee)19.53%,β折叠(Tt)8.33%,无规则卷曲(Cc)33.59%;此酶以2r11.1.A(有机磷水解酶)序列为模板一致性达99.39%,覆盖度86%,OPD蛋白三级结构含有2个铜原子,该酶将为今后基因工程菌的构建提供理论依据。
【学位授予单位】：哈尔滨商业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172;X592;TQ925

【参考文献】