水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析

发布时间：2017-04-03 00:20

  本文关键词：水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：水稻是世界性的粮食作物,其产量以及品质受逆境胁迫的影响非常显著。因此水稻抗逆研究一直是稻作科学研究的重要课题。近年来,随着分子生物学理论与技术的进步,逆境相关基因的研究取得了很大进展,一些逆境相关基因已被相继发现并被克隆到水稻中,并获得了抗逆性提高的转基因植株。这将有助于了解水稻在耐逆方面的分子作用机制,为筛选和培育水稻抗逆品种提供了重要的指导意义。热激蛋白(Heat Shock Protein)HSP90是生物体内广泛存在的一类重要的逆境相关蛋白,不仅在逆境条件下高效表达,而且在正常生活的细胞中也广泛存在。作为生物体内重要的分子伴侣之一,它能在正常以及逆境胁迫下,帮助作用蛋白正确完成折叠、使其空间构象保持完整以及维持其生物学功能,同时与许多底物蛋白结合形成复合体参与调控细胞生理代谢及信号转导。此外,大量研究表明其超表达后能够增强植物体的抗逆性。本研究室在早期阶段通过荧光差显技术筛选到一个水稻热激蛋白HSP90,其定位在水稻日本晴9号染色体上。在此基础上,本论文主要讨论了它在水稻体内所行使的一些生物学功能,为进一步深入研究OsHsp90基因在逆境应答中所起的调控作用打下一定基础。主要研究结果如下：1.对OsHSP90基因进行生物信息学分析发现,该基因编码框为2100 bp,编码699个氨基酸,等电点约为4.97,预测分子量为80.19 kDa。蛋白质结构域分析表明第30-179 AA残基构成一个ATPase结构域,第185-699 AA残基是Hsp90蛋白超家族典型结构域。2.运用实时qRT-PCR技术分析了水稻日本晴中OsHSP90基因在高温、干旱、盐胁迫等逆境处理下的表达情况,发现OsHSP90基因是一个多逆境诱导基因,并且受热激影响最显著。3.构建了该基因的原核表达载体,并对其进行了体外诱导表达,同时探究了表达OsHSP90蛋白的大肠杆菌在逆境条件下的生长状况,结果显示该基因的表达能增强大肠杆菌的耐高温性和耐渗透胁迫性,而与大肠杆菌的耐盐性的提高似乎没有太大关系。4.构建了其转基因表达载体,获得了相应的转基因纯合植株,然后对其进行了高温胁迫、盐胁迫、干旱胁迫逆境处理,发现OsHSP90的超表达能增强水稻对高温胁迫的抗逆性,与水稻耐旱性的提高也有一定关系,而对水稻耐盐性的提高似乎没什么直接作用。5.构建了该基因的GFP载体,以确定其亚细胞定位,不过实验还在进行之中。
【关键词】：水稻 OsHSP90 转基因 原核表达 逆境处理
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文献综述10-24
• 第一节 植物逆境生理10-14
• 1. 高温胁迫对植物的影响10-13
• 1.1 高温胁迫对植物生长发育的影响10-11
• 1.2 高温胁迫对细胞膜结构的破坏11
• 1.3 高温抑制植物的光合作有和呼吸作用11
• 1.4 高温胁迫对植物外观形态的影响11-12
• 1.5 高温对植物体内水分影响12
• 1.6 高温胁迫对植物抗氧化系统的影响12
• 1.7 高温胁迫对植物激素的影响12-13
• 2、其他逆境胁迫对植物的影响13-14
• 2.1 干旱胁迫对植物的影响13
• 2.2 低温胁迫对植物的影响13-14
• 2.3 高盐胁迫对植物的影响14
• 第二节 热激蛋白(Hsps)研究进展14-24
• 1. Hsp的发现14-15
• 2. Hsp的分类15
• 3. Hsp的结构上特点15-16
• 4. Hsp的主要功能16-18
• 4.1 Hsp的分子伴侣功能16
• 4.2 Hsp与信号传递16-17
• 4.3 Hsp调控细胞凋亡17
• 4.4 Hsp与植物的抗逆性17-18
• 5. Hsp90家族研究进展18-19
• 5.1 HSP90家族18-19
• 5.2 HSP90家族功能域19
• 6 实时荧光定量PCR19-22
• 6.1 实时荧光定量PCR的原理20
• 6.2 实时荧光定量PCR的检测方法20-21
• 6.3 实时定量PCR的优点21
• 6.4 实时定量PCR的缺点21-22
• 6.5 实时定量PCR技术的应用22
• 6.6 实时荧光定量PCR的展望22
• 7. 本研究的目的与意义22-24
• 第二章 OsHsp90基因的克隆及表达分析24-38
• 1. 材料与方法24-31
• 1.1 植物材料、菌种和载体24
• 1.2 主要仪器24
• 1.3 主要试剂及培养基24-25
• 1.3.1 主要试剂24-25
• 1.3.2 主要培养基25
• 1.4 实验方法25-30
• 1.4.1 水稻日本晴逆境处理25-26
• 1.4.2 处理样品RNA提取26
• 1.4.3 RNA纯化26-27
• 1.4.4 RNA反转录27
• 1.4.5 OsHSP90基因的克隆27-30
• 1.5 实时荧光定量PCR30-31
• 1.5.1 引物设计30-31
• 1.5.2 实时荧光定量PCR31
• 1.5.3 实时荧光定量PCR数据处理31
• 2. 结果与分析31-38
• 2.1 OsHSP90基因的克隆31-32
• 2.2 OsHSP90基因生物信息学分析32-35
• 2.2.1 OsHSP90基因的启动子序列分析32-33
• 2.2.2 OsHSP90蛋白的氨基酸序列分析及系统发育树的构建33-35
• 2.3 OsHSP90基因的在线表达分析35-36
• 2.4 OsHSP90基因在逆境条件下的表达分析36-38
• 第三章 OsHSP90基因的原核表达及抗逆试验38-48
• 1. 材料与方法38-43
• 1.1 菌株和质粒38
• 1.2 主要仪器38
• 1.3 主要试剂和培养基38-39
• 1.4 实验方法39-43
• 1.4.1 pET-32a：OsHSP90载体的构建39-40
• 1.4.2 融合蛋白的表达40-42
• 1.4.3 纯化融合蛋白42
• 1.4.4 表达水稻OsHSP90的大肠杆菌的抗逆实验42-43
• 2. 结果与分析43-48
• 2.1 pET-32a：OsHSP90重组载体的构建43-44
• 2.2 融合蛋白的表达44-45
• 2.3 表达OsHSP90蛋白的大肠杆菌的抗逆分析45-48
• 第四章 OsHSP90转基因植株的获得48-67
• 1. 材料与方法48-61
• 1.1 植物材料、菌株及载体48-49
• 1.2 主要试剂及培养基49
• 1.2.1 主要试剂49
• 1.2.2 主要培养基49
• 1.3 主要仪器49-50
• 1.4 实验方法50-61
• 1.4.1 pCAMBIA1300：OsHSP90超表达载体及抑制表达载体的构建50-52
• 1.4.2 pCAMBIA1300：OsHSP90-GFP载体的构建52-55
• 1.4.3 农杆菌介导的转基因载体遗传转化55-56
• 1.4.4 转基因水稻的获得56-57
• 1.4.6 转基因水稻的检测57-59
• 1.4.7 水稻原生质体的制备及转化59-61
• 1.4.8 实时qRT-PCR检测转基因植株61
• 2. 结果与分析61-67
• 2.1 pCAMBIA1300：OsHSP90超表达载体以及反义载体的构建61-62
• 2.2 重组pCAMBIA1300：OsHSP90-GFP载体的构建62-63
• 2.3 转基因水稻的获得63
• 2.4 OsHSP90阳性转基因植株的检测63-67
• 2.4.1 潮霉素抗性的快速检测63-64
• 2.4.2 PCR法鉴定转基因植株64-65
• 2.4.3 后代转基因种子潮霉素发芽检测65-66
• 2.4.4 转基因幼苗中OsHSP90基因的表达量检测66-67
• 第五章 T2代纯合转基因植株逆境处理67-76
• 1. 材料与方法67-68
• 1.1 实验材料67
• 1.2 药品及培养基67
• 1.3 实验方法67-68
• 2. 结果与分析68-76
• 第六章 总结与讨论76-79
• 参考文献79-85
• 致谢85-86
• 攻读硕士期间参与发表论文86

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1 杜延飞;水稻OsHSP90基因的克隆及功能初步分析[D];四川农业大学;2015年

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本文编号：283413