卡那霉素生物降解及生产菌渣再利用

发布时间：2020-10-14 01:13

　　 卡那霉素是氨基糖苷类抗生素中的重要一员,一方面具有价格便宜、高效和过敏反应少等优点得到广泛的应用,另一方面环境中抗生素的残留极大促进耐药性的产生,对医疗保健是一大威胁。本研究主要有以下几个方面：筛选卡那霉素降解菌,研究降解菌生长和降解特性,及其处理卡那霉素废水和菌渣的效果；研究从降解菌中提取的卡那霉素降解酶酶学活性,为其应用于处理环境中抗生素残留提供理论基础；通过物理、化学、生物法对卡那霉素发酵菌渣改性,重新用做发酵培养基氮源；通过卡那链霉菌诱变育种,提高卡那霉素产量。本论文主要内容和结果如下：1.通过利用卡那霉素为唯一碳源的无机盐培养基,从卡那霉素富集土壤和活性污泥中筛选出3株高效降解菌,A1、A2和A3。三个株菌均为革兰氏阴性菌,其中降解菌A2降解能力最强,经过16sDNA和生理生化鉴定,A1、A2属于副球菌Paracoccus kondratievae, A3属于Aquamicrobium sp。2.研究了降解菌A2生长和降解特性。A2在LB培养基中培养时,0-5 h处于延迟期、5 h后进入对数期、11 h进入稳定期；利用logistics方程分析发现,添加0、200 mg/L.1000 mg/L卡那霉素,A2的生长曲线仅初始阶段对降解菌具有抑制作用,浓度越大抑制作用越强；A2最适生长条件为pH6-9,37℃; 1mM的Cd2+抑制A2的生长,1 mM-10 mM的Mg2+对A2的生长有微弱的促进作用,10 mM的Zn2+、Cu2+、Co2+、Ni2+、Fe3+、Ca2+、Ba2+、Cd2+和Mn2+对A2的生长有不同程度的抑制作用：A2也能在100 mg/L的链霉素和庆大霉素的培养基中生长。在以卡那霉素为唯一碳源的基础培养基中培养时,降解菌A2能耐受高达16000mg/L的卡那霉素,最适降解温度37℃；外加0.2%的葡萄糖、麦芽糖、牛肉膏、酵母膏、淀粉和蛋白胨对A2的降解能力有不同程度的促进作用,甘露醇和蔗糖对A2降解能力有所抑制；基础无机盐培养基中添加0.2%的MgSO4皂极大促进A2的生长；外加0.05%不同金属离子,除Fe3+对A2的降解能力影响不显著,Mn2+、Co2+、Cu2+、Ba2+、Ni2、Cd2+、Zn。+和A13+都对A2的降解能力有不同程度抑制作用。3.研究了降解菌株A2处理卡那霉素废水的降解效果：废水中卡那霉素浓度高低对其完全降解所需要的时间有显著影响,25%浓度卡那霉素废水在24 h内可完全降解,100%浓度废液中的卡那霉素很难被完全降解,72h仍有3.21 mg/L残留；A2菌株对过滤除菌废水和未除菌废水的降解效果相当,但前者生物量要高于后者,说明废水中其他微生物的存在对A2的降解能力无显著的影响。4.利用降解菌株A2处理卡那霉素发酵菌渣：处理24 h内具有较高的降解效率；接种量按菌渣质量的10%-70%,接种量越高,A2对菌渣中卡那霉素降解率越高,当接种量从1O%增加到30%,对降解率提升幅度最大,达34.13%；菌渣的加水量按菌渣质量的30%-90%-著影响卡那霉素降解,水分越多,降解效果越好,对比加水量90%和120%,卡那霉素的降解变化不大,两者降解率仅相差1.62%；外加1%的碳氮源,葡萄糖和牛肉膏抑制卡那霉素降解,蛋白胨对降解率基本无影响、酵母膏对降解率有促进作用。5.分别比较降解菌A2发酵液、胞内酶液、胞外酶液以及细胞碎片悬浮液对卡那霉素降解能力,表明降解组分属于胞内酶,进一步研究发现该酶为组成型酶；通过正交实验优化胞内酶提取条件,确定最佳条件：超声破碎功率300 W、频率超声2s间隔2s、时间20 min；该酶适合降解条件为pH4.5-6.5,35℃; 0.1 mM的Fe3+对酶活有促进作用,Mn2+、Zn2+、Co2+、Ni2+和Cu2+对酶活有显著的抑制作用,Cu2+抑制作用最大；通过不同底物浓度酶促降解特性结合米氏方程求得该酶的米氏常数为371.65 mg/L;6.发酵菌渣替代氮源实验表明,菌渣完全替代卡那霉素发酵培养基中的黄豆饼粉效果不佳,即使经过NaOH改性,仅有50%的效价；菌渣部分替代黄豆饼粉效果则非常显著,菌渣添加量0.5%～2.5%(替代原发酵培养基中14.28%～71.43%的黄豆饼粉)均都能超过90%以上原效价；新鲜菌渣与发酵菌渣混合发酵,混合比1：1能获得良好的改性效果,替代57.14%的黄豆饼粉发酵效果达到90%以上。7.本文还研究了利用乙烯亚胺诱变卡那链霉菌获取高产菌株,最终获得三株产量较高的菌株,经过2代传代,发现菌株有所退化,其中菌株Y9效价较高,比原始菌株提高13%。
【学位单位】：福建师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X172;X787
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
中文文摘
绪论
    1.1 氨基糖苷类抗生素介绍
    1.2 抗生素存在问题
    1.3 抗生素残留的无害化处理手段
        1.3.1 高温降解法
        1.3.2 化学处理
        1.3.3 生物法
        1.3.4 酶法降解
    1.4 抗生素废菌渣的再利用研究进展
        1.4.1 抗生素菌渣的理化特点
        1.4.2 抗生素菌渣资源化再利用
    1.5 微生物育种
        1.5.1 传统诱变育种
        1.5.2 基因工程育种
        1.5.3 基因组改组技术
        1.5.4 代谢工程育种
    1.6 研究内容和意义
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究意义
第一章 卡那霉素降解菌分离鉴定
    1.1 前言
    1.2 材料和方法
        1.2.1 材料
        1.2.2 方法
    1.3 结果与分析
        1.3.1 卡那霉素降解菌初筛及分离纯化
        1.3.2 复筛
        1.3.3 比较降解菌A1、A2、A3和A4对卡那霉素的降解能力
        1.3.4 降解菌A2菌株的生化鉴定
        1.3.5 降解菌A1、A2和A3的16sDNA鉴定及构建系统进化树
    1.4 小结与讨论
第二章 高效降解菌A2的生长以及降解特性研究
    2.1 前言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
    2.3 结果与分析
        2.3.1 绘制卡那霉素降解菌A2生长曲线
        2.3.2 不同浓度的卡那霉素下,降解菌A2的生长动力学变化
        2.3.3 不同pH对降解菌A2生长的影响
        2.3.4 不同温度对菌株生长的影响
        2.3.5 添加不同金属离子对A2菌株的生长的影响
        2.3.6 降解菌A2对卡那霉素的耐受能力
        2.3.7 降解菌A2对链霉素、庆大霉素的抗性
        2.3.8 温度对降解菌A2降解能力的影响
        2.3.9 外加0.2%的碳氮源对降解菌A2降解能力的影响
2+对降解菌A2生长的影响'>        2.3.10 无机盐培养基中Mg²⁺对降解菌A2生长的影响
        2.3.11 不同金属离子对降解菌A2降解能力的影响
    2.4 小结与讨论
第三章 降解菌A2处理卡那霉素发酵废渣和废液
    3.1 前言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
    3.3 结果与分析
        3.3.1 降解菌A2处理卡那霉素废液效果研究
        3.3.2 培养时间对菌渣中卡那霉素降解效果
        3.3.3 不同接菌量对菌渣中卡那霉素降解的影响
        3.3.4 不同加水量对降解效果的影响
        3.3.5 外加碳氮源对降解菌A2降解菌渣中卡那霉素的影响
    3.4 小结与讨论
第四章 降解酶酶学性质研究
    4.1 前言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 结果与分析
        4.3.1 降解酶的定位及判断该酶属于诱导酶还是组成酶
        4.3.2 不同超声功率对胞内酶活性的影响
        4.3.3 正交实验优化胞内粗酶液的超声破碎提取条件
        4.3.4 不同温度对降解酶活性的影响
        4.3.5 不同pH对降解酶活性的影响
        4.3.6 卡那霉素降解菌酶促降解动力学曲线
        4.3.7 降解酶对不同浓度底物的酶促降解特性及米氏常数的确定
        4.3.8 不同金属离子对酶活的影响
    4.4 小结与讨论
第五章 卡那霉素发酵菌渣重新用做氮源的再利用研究
    5.1 前言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
    5.3 结果与分析
        5.3.1 菌渣理化特性
        5.3.2 菌渣A完全取代培养基中的黄豆饼粉
        5.3.3 比较不同方式预处理的菌渣以3.5%加量完全替代黄豆饼粉效果
        5.3.4 用NaOH预处理菌渣完全替代黄豆饼粉的添加量优化
        5.3.5 菌渣部分替代培养基中的黄豆饼粉效果研究
        5.3.6 对比NaOH处理菌渣与未处理菌渣以2%的添加量部分替代发酵培养基中的黄豆饼粉效果
        5.3.7 发酵菌渣和新鲜菌渣混合发酵效果研究
    5.4 小结与讨论
第六章 卡那链霉菌的诱变育种
    6.1 前言
    6.2 实验材料和方法
        6.2.1 实验材料
        6.2.2 方法
    6.3 结果与分析
        6.3.1 乙烯亚胺致死曲线
        6.3.2 0.12%乙烯亚胺诱变育种
        6.3.3 研究相对高产菌株编Y9,Y23,Y26的传代稳定性
    6.4 小结与讨论
第七章 结论与展望
    7.1 研究结论
    7.2 展望
参考文献
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
致谢
个人简历

【参考文献】

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本文编号：2839959