胸苷磷酸化酶两种酵母表面展示系统的构建及应用

发布时间：2020-10-11 18:36

　　 胸腺嘧啶脱氧核苷磷酸化酶(Thymidine Phosphorylase,TP)是一种核苷磷酸化酶,它在微生物和真核生物体内普遍存在,在核苷酸代谢过程尤其是补救合成途径中发挥重要作用,通过转糖苷作用可催化生成多种核苷类化合物。但目前工业中用来制备核苷类化合物的方法主要是化学法,化学法的反应条件要求高,步骤较繁琐且污染环境。而近年来兴起的酵母表面展示技术可以集酶的表达、纯化和固定于一体的,催化效率高,是一种可重复利用且处理工艺简单的催化平台。本文分别基于两种不同的锚定系统,构建了TP的毕赤酵母和酿酒酵母表面展示系统,探索了将其作为全细胞催化剂制备核苷类化合物的可能性。本文从大肠杆菌K12菌株中克隆编码TP的deo A基因,利用酵母表达质粒p KFS构建了重组质粒p KFS-LA,电击转入GS115细胞,构建了毕赤酵母的重组转化子。高拷贝阳性转化子经甲醇诱导96 h后,免疫荧光结果显示TP在酵母细胞表面成功展示。利用30 m M的!-胸苷为底物,重组酵母细胞作为全细胞催化剂,在50℃下反应2 h。经HPLC检测结果表明展示在酵母表面的TP具有催化活性,可以催化!-胸苷生成产物胸腺嘧啶,转化率为7.5%。另外,本论文同时利用酵母表达质粒p YD1构建了重组质粒p YD1-deo A,利用PEG1000化学转化酿酒酵母EBY100菌株,构建了酿酒酵母转化子。阳性转化子经半乳糖诱导48 h后,进行免疫荧光检测,结果表明TP成功表达在酿酒酵母表面;在50℃下以酿酒酵母转化子为全细胞催化剂反应2 h,对30 m M!-胸苷的催化活性经HPLC检测为10.87%。利用酿酒酵母转化子为催化剂,通过对其他核苷类化合物如5-氮杂胞苷的催化反应检测,发现TP具有较高的底物特异性,可以催化尿嘧啶核苷类化合物,但无法催化胞嘧啶核苷类化合物的转糖苷反应。本论文利用酵母表面展示技术,成功构建了胸苷磷酸化酶的毕赤酵母转化子和酿酒酵母转化子,且均具有催化活性。本课题为利用生物酶法合成核苷类化合物及相关研究奠定了基础。
【学位单位】：清华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q78
【文章目录】：
摘要
Abstract
主要符号对照表
第1章 引言
    1.1 核苷类化合物的介绍
    1.2 重要核苷类化合物的制备
    1.3 核苷磷酸化酶
    1.4 微生物表面展示技术
    1.5 课题研究目的和意义
    1.6 论文各部分主要内容
第2章 胸苷磷酸化酶的毕赤酵母表面展示系统的构建
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株和质粒
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 设备和仪器
        2.1.4 培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 实验流程
        2.2.2 PCR扩增目的基因
        2.2.3 构建目的基因的真核表达重组质粒
        2.2.4 毕赤酵母GS115细胞感受态的制备及重组质粒的转化
        2.2.5 Western blot验证目的蛋白的表达
        2.2.6 免疫荧光染色实验
        2.2.7 酵母转化子的催化活性检测
    2.3 实验结果与讨论
        2.3.1 胸苷磷酸化酶基因的克隆
        2.3.2 真核表达重组质粒pKFS-LA的构建
        2.3.3 高拷贝酵母转化子的筛选
        2.3.4 目的蛋白在GS115细胞表面展示情况的检测
        2.3.5 目的蛋白的western blot检测
        2.3.6 毕赤酵母转化子的催化活性检测
    2.4 本章小结
第3章 胸苷磷酸化酶的酿酒酵母表面展示系统的构建
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 实验试剂
        3.1.3 设备和仪器
        3.1.4 培养基
    3.2 实验方法
        3.2.1 实验流程
        3.2.2 PCR扩增目的基因
        3.2.3 构建目的基因的真核表达重组质粒
        3.2.4 EBY100酵母细胞感受态的制备及重组质粒的转化
        3.2.5 Western blot检测目的蛋白的表达
        3.2.6 免疫荧光染色实验
        3.2.7 酵母转化子的催化活性检测
    3.3 实验结果与讨论
        3.3.1 胸苷磷酸化酶基因的克隆
        3.3.2 真核表达重组质粒pYD1-deoA的构建
        3.3.3 酿酒酵母阳性转化子的筛选
        3.3.4 酿酒酵母细胞的诱导培养
        3.3.5 目的蛋白在酵母细胞表面展示情况的检测
        3.3.6 Western blot检测目的蛋白的表达
        3.3.7 酿酒酵母转化子的催化活性检测
    3.4 本章小结
第4章 结论及展望
    4.1 结论
    4.2 其它研究工作
    4.3 展望
参考文献
致谢
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果

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本文编号：2836968