Lhx8基因对新生大鼠海马胆碱能神经元和GABA能神经元的影响

发布时间：2020-10-11 16:18

　　 目的:Lhx8基因对于胆碱能和GABA能神经元的发生分化发育有重要作用,但其在新生鼠神经元发育中的作用尚不明确,尤其是Lhx8基因对于GABA能神经元的调节作用尚未得到一致的认同,基于此,本实验采用包含有Tet-on系统的慢病毒来调控Lhx8的表达,研究过表达Lhx8对于新生大鼠脑内胆碱能神经元和GABA能神经元的影响。方法:从Gene Bank中调取Rattus norvegicus Lhx8(rLhx8)序列,上游加入Kozak序列,人工合成全序列,链接入pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo质粒产生载体质粒pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo,对获得的质粒进行鉴定和扩增;使用293T细胞进行慢病毒包装,并使用293T细胞检测其感染能力;将获得的含有大鼠Lhx8(rLhx8)的慢病毒及其相应对照慢病毒对新生大鼠进行脑室注射,给予0.5mg/ml四环素诱导rLhx8的表达,在注射病毒48h,72h和96h后,每只新生大鼠取左侧海马提取RNA,右侧海马提取蛋白质,通过RT-PCR和Western blot检测新生大鼠脑内胆碱能神经元表面标志物(Choline Acetyltransferase,CHAT)和GABA能神经元表面标志物(Glutamic Acid Decarboxylases 65,GAD65)表达的变化,取全脑制备石蜡切片,利用免疫荧光组织化学技术检测CHAT和GAD65的表达,利用荧光显微镜观察染色结果,每只大鼠选择4张切片,每张切片选择4个视野观察拍照,所获得的图片经过Ipwin检测平均荧光密度,取平均值,经过Graphpad来对各组数据进行平均值和方差计算,组间比较使用t检验,P0.05表示具有统计学意义。结果:包装质粒(pLP1,pLP2和pLP/VSVG)、载体质粒(pLVX-Tight-IRES-Zs Green-Neo和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo)和调控质粒(pLVX-Tet-On-Puro)鉴定成功后,对其进行扩增,通过大提试剂盒可得到满足实验需求的质粒。pLP1,pLP2,pLP/VSVG,pLVX-Tet-On-Puro和pLVX-Tight-rLhx8-IRES-Zs Green-Neo五质粒共转染293T细胞,可见绿色荧光,收集上清,离心沉淀获得慢病毒,同时用其感染293T细胞,表明慢病毒具有感染能力。RT-PCR结果表明,诱导Lhx8基因过表达48h时,各组间检测指标无差异;72h及96h时,胆碱能神经元表面标志物CHAT增加,GABA能神经元表面标志物GAD65减少(P0.05,n=4),有统计学意义。新生大鼠海马免疫荧光染色结果表明,慢病毒载体介导的外源Lxh8基因的过表达,使新生大鼠海马CHAT阳性表达细胞数增加,使GAD65阳性表达细胞数减少,(P0.05,n=4),有统计学意义。Western blot结果表明,慢病毒注射四环素诱导48h时,实验组各组间没有差异,72h及96h时,GAD65的蛋白翻译水平有降低,(P0.05,n=4),有统计学意义。结论:在新生大鼠海马部,诱导Lhx8基因过表达72h及96h后能够促进胆碱能神经元的标志物CHAT表达,抑制GABA能神经元表面标志物GAD65的表达。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R338
【文章目录】：
前言
摘要
Abstract
英文缩略词
第1章 文献综述
第2章 材料与方法
    2.1 实验试剂
    2.2 实验仪器
    2.3 实验细胞及动物
        2.3.1 实验细胞
        2.3.2 实验动物
    2.4 实验试剂配制
    2.5 实验方法
        2.5.1 质粒的获得、鉴定及扩增
        2.5.2 293T细胞培养
        2.5.3 慢病毒包装
        2.5.4 新生大鼠慢病毒脑室注射及取材
        2.5.5 RT-PCR技术检测慢病毒注射后新生大鼠海马胆碱能及GABA能神经元的表达水平
        2.5.6 Western Blot技术检测慢病毒毒注射后新生大鼠海马GABA能神经元的蛋白表达水平
        2.5.7 CHAT及GAD65的免疫荧光染色
    2.6 统计学分析
第3章 实验结果
    3.1 质粒的构建扩增及鉴定
        3.1.1 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo质粒构建
        3.1.2 pLP1，pLP/VSVG及pLVX-Tight-IRES-ZsGreen-Neo质粒图谱及鉴定
        3.1.3 pLP2质粒图谱及鉴定
        3.1.4 pLVX-Tight-rLhx8-IRES-ZsGreen-Neo和pLVX--Tet-On-Puro质粒图谱及鉴定
    3.2 慢病毒包装
    3.3 新生大鼠侧脑室注射
    3.4 RT-PCR检测组织中rLhx8、GAD65和CHAT的表达情况
    3.5 各组海马组织中CHAT和GAD65的免疫荧光检测结果
    3.6 Western blot检测各组组织中GAD65的表达情况
第4章 讨论
第5章 结论
参考文献
研究生期间所取得的科研成果
致谢

【参考文献】

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本文编号：2836828