禽多杀性巴氏杆菌crp、phoP基因的功能研究及其突变株免疫效力的初步评价

发布时间：2020-10-17 18:33

　　 多杀性巴氏杆菌是能引起多种动物致病的革兰氏阴性菌。现有研究表明,以全局调控基因crp或phoP为靶基因在大肠杆菌或沙门氏菌进行疫苗开发研究卓有成效。然而,在多杀性巴氏杆菌中对这两个基因的相关研究还相当匮乏,基于此,我们的研究结果如下：1、潜在基因的筛选鉴定：将潜在的多杀性巴氏杆菌crp、phoPi：含两段潜在序列,分别命名为phoP1和phoP2)基因分别克隆至低拷贝质粒pYA3332后引入沙门氏菌相应突变株,利用麦康凯显色试验成功鉴定多杀性巴氏杆菌crp基因,利用X-P平板显色试验和多粘菌素B抗性试验确定phoP2基因为真正的多杀性巴氏杆菌phoP基因。同时,制备了Crp和PhoP的兔源多克隆抗体；2、突变株构建：通过自杀质粒pYA4278介导的同源重组方法,成功地构建的禽源多杀性巴氏杆菌Pasteurella multocida DY120818株crp、phoP基因缺失株。两基因缺失株均遗传稳定性良好。根据后续试验需要,基于大肠杆菌-巴氏杆菌科穿梭质粒pMC-express,成功地构建P. multocida DY120818 crp基因缺失株的互补株；3、生物学功能鉴定：多杀性巴氏杆菌缺失crp基因后,菌株的生长速度明显减缓,对部分碳源和氨基酸代谢能力改变；表型特征(外膜蛋白和脂多糖图谱)无明显变化,对鸭血清的敏感性显著升高,在雏鸭模型中通过口服途径和滴鼻途径攻毒,毒力分别较野生株降低了22倍和86倍；多杀性巴氏杆菌缺失phoP基因后,菌株的生长速度、代谢能力、表现特征和血清敏感性均无明显变化,在雏鸭模型中测定力通过口服途径和滴鼻途径攻毒,毒力分别较野生株降低了32倍和154倍；4、免疫保护力测定：雏鸭经滴鼻免疫P. multocida DY120818 △crp株活菌,或经口服免疫P. multocida DY120818 △phoP株活菌,用野生株攻毒,分别能达到60%和54.5%的保护效力。然后,采用P. multocida DY120818野生型灭活全菌菌体或外膜蛋白分别检测免疫后雏鸭血清IgY和胆汁IgA水平,均能检测到较强的体液免疫和粘膜免疫应答水平；5、转录组测序分析：在相同培养条件下,对禽多杀性巴氏杆菌P. multocida DY120818野生型,crp和phoP基因缺失株分别进行转录组测序,以野生型数据为对照,分别在phoP基因缺失株中得到186个、334个差异表达基因；通过对这些差异表达基因进行包括GO功能注释、KEGG通路在内的生物信息学分析,对多杀性巴氏杆菌转录因子phoP基因的调控功能得到初步了解。总之,在本研究中,我们首次在多杀性巴氏杆菌中对全局调控基因、phoP基因进行了功能鉴定,并在强毒株P. multocida DY120818中分别构建了crp和phoP基因突变株,鉴定了这两个基因对细菌生长、生化代谢、LPS和OMPs图谱结构,血清敏感性和毒力等生物学功能方面的影响；测定了以上两个基因缺失株以活菌疫苗疫苗的形式免疫雏鸭后的免疫保护效应；更进一步地,依靠转录组测序技术,对基因突变株中差异表达基因进行分析,为进一步了解多杀性巴氏杆菌中crp、phoP的转录调控功能奠定了基础。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.61
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩写词表
第一部分 文献综述
    一 多杀性巴氏杆菌综述
        1 多杀性巴氏杆菌的生物学特性
            1.1 形态特征
            1.2 生长要求和培养条件
            1.3 生化特性
            1.4 实验室诊断
        2 多杀性巴氏杆菌流行病学特征
        3 多杀性巴氏杆菌的毒力因子
    二 crp、phoP基因对细菌毒力的影响及其在巴氏杆菌中的研究进展
        1 crp基因对细菌毒力的影响及其在P.multocida中的研究进展
        2 phoP基因对细菌毒力的影响及其在P.multocida中的研究进展
    三 研究目的及意义
第二部分 试验研究
    四 多杀性巴氏杆菌潜在crp、phoP基因的鉴定、克隆表达及其多克隆抗体的制备
        1 材料
            1.1 菌株和质粒
            1.2 引物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
            1.5 实验动物
        2 试验方法
            2.1 多杀性巴氏杆菌潜在crp、phoP基因的筛选
            2.2 多杀性巴氏杆菌潜在crp、phoP基因的功能鉴定
            2.3 多杀性巴氏杆菌crp、phoP基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备
        3 试验结果
            3.1 多杀性巴氏杆菌潜在crp、phoP基因的克隆
            3.2 异源功能互补鉴定多杀性巴氏杆菌crp、phoP基因
            3.3 多杀性巴氏杆菌crp、phoP基因的克隆表达与纯化
        4 讨论
        5 结论
    五多杀性巴氏杆菌crp、phop基因缺失株及其互补株的构建
        1 材料
            1.1 菌株和质粒
            1.2 引物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 自杀质粒的构建
            2.2 crp、phop基因缺失株的筛选和鉴定
            2.3 crp基因缺失株的互补株的构建
        3 试验结果
            3.1 重组自杀质粒的构建
            3.2 突变株的构建与筛选
            3.3 基因缺失株的遗传稳定性检测
            3.4 crp基因缺失株互补株的构建
        4 讨论
        5 结论
    六多杀性巴氏杆菌crp、phoP基因生物学功能鉴定
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 生长特性
            2.2 生化鉴定
            2.3 表型鉴定
            2.4 血清敏感性试验
            2.5 毒力测定
        3 试验结果
            3.1 生长曲线
            3.2 生化鉴定
            3.3 表型鉴定
            3.4 清敏感试验
            3.5 毒力试验
        4 讨论
        5 结论
    七基因缺失株在雏鸭体内的免疫保护水平检测
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 实验动物
            1.3 主要试剂
            1.4 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 雏鸭的免疫
            2.2 抗体水平检测
        3 试验结果
            3.1 保护力测定
            3.2 抗体水平测定
        4 讨论
        5 结论
    八 crp、phoP基因缺失株差异表达基因分析
        1 材料
            1.1 菌株
            1.2 主要试剂
            1.3 主要仪器
        2 试验方法
            2.1 菌体样品的准备
            2.2 测序试验流程
            2.3 信息分析流程
        3 试验结果
            3.1 测序数据的质控、剪切与统计
            3.2 全基因GO功能注
            3.3 全基因组KEGG通路注释
            3.4 基因的差异表达分析
            3.5 差异基因的GO注释
            3.6 差异基因的GO功能富集分析
            3.7 差异基因的KEGG通路显著性富集分析
        4 讨论
            4.1 关于转录组测序
            4.2 关于多杀性巴氏杆菌Crp、PhoP转录调控子
        5 小结
参考文献
致谢
作者简介
攻读硕士学位期间完成的学术论文
附录

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本文编号：2845167