猪圆环病毒2型荧光定量PCR快速检测试剂盒申报药证的前期研究

发布时间：2020-10-27 18:22

　　 根据市场调查显示,猪肉是市民需求量最多的肉制食物。猪圆环病毒(Porcine Circovirus Type,PCV)中的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是影响猪生长发育及繁殖的困扰因素之一。猪圆环病毒2型是引起是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS)的主要病原,从而给养猪业带来巨大的经济损失。因此,有必要开发出一种定性、定量快速检测猪的PCV2的方法。本实验室已建立PCV2荧光定量PCR快速定性、定量检测技术,并且用该技术研制出试剂盒,命名为猪圆环病毒2型(PCV2)荧光定量PCR快速检测试剂盒,目前处于药证申报阶段。本实验采用荧光定量PCR技术来定性和定量检测PCV2,通过制作标准曲线进行定量检测病毒含量。可通过此方法判断感染猪患PCV2的程度,进行检测、隔离和淘汰猪仔。本论文主要针对该试剂盒的原材料、生产工艺及反应体系进行研究。主要内容及结果如下:在试剂盒原材料研究中,对原材料进行比对和优选,分别对三家公司生产的Taq酶、PCR反应缓冲液和UDG酶进行比对试验。在qPCR扩增结果中Takara宝生物工程(上海)有限公司的Taq酶和PCR反应缓冲液的Ct值和荧光增长值最高,扩增效率最好;上海博彩生物科技公司的UDG酶能有效去除污染,且质优价廉;同时为试剂盒制备了参考品,其阳性参考品的Ct值在20-25、最低检测限参考品的Ct值在30-35、精密性参考品的Ct值在20-25、阴性参考品无扩增曲线和Ct值。在试剂盒的生产工艺研究中,对影响生产工艺的因素温度进行了研究,即高浓度样本、中浓度样本和低浓度样本分别在冻融次数、2-8℃、-20℃、-70℃和低温运输时的最适保存期限进行了研究。其中被测中浓度样本于-20℃储存条件下反复冻融其核酸浓度会降低,冻融次数超过5次后荧光增长值会从4.13减弱到1以下,所以建议冻融次数一般不超过5次。同样原理,不同浓度样本在室温下模拟冰袋低温运输0小时(hour,h)、24 h、48、72 h、96 h和120 h后,其核酸浓度会降低,在运输72 h之前的样本的Ct值的CV值都小于5%,而低浓度样本在运输96 h时的Ct值明显滞后,CV值大于5%。因此综合考虑样品在冰袋低温运输不宜超过96 h。不同浓度的样本在2-8℃的存储0天、1天、2天、3天、4天和5天时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,高浓度样本的变异系数都小于5%,中浓度样本在储存第5天时,其变异系数大于5%,低浓度样本第4天时Ct值的变异系数大于5%,因此将3天作为2-8℃存储条件下的样本有效期。不同浓度样本在-20℃存储0天、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,同理将6个月作为-20℃的保存期限。不同浓度样本在-70℃存储0天、1个月、2个月、4个月、6个月、8个月、10个月、12个月时分别进行核酸提取和qPCR扩增检测,同理将12个月作为-70℃的保存期限。在试剂盒总反应体系分别为12.5μL,25μL和50μL的相关用量试验中,25μL体系和50μL体系结果显示样本均获得较高的荧光信号值,12.5μL的反应体系中灵敏度不高且荧光增长值较低,50μL体系灵敏度高易造成假阳性且耗费试剂多一倍。因此将25μL作为总反应体系。
【学位单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S852.651
【部分图文】：

上海师范大学硕士学位论文第一章绪论1第1章绪论1.1猪圆环病毒简介1.1.1猪圆环病毒基因组和分子生物学结构猪圆环病毒（PCV），属于圆环病毒科圆环病毒属成员，由德国人Tischer于1974年首次在猪肾细胞系(PigKidney－15Cells，PK－15)中发现，1982年确定该病毒大小是17－22nm的环状DNA病毒，并被命名为猪圆环病毒，是迄今为止动物病毒中最小的DNA病毒[1]。PCV病毒呈二十面体对称结构，无囊膜，由衣壳蛋白和基因组组成。基因组是一条共价单股环状DNA病毒，全长1766－1768bp。根据病毒的基因组成和抗原性的不同，病毒主要分为猪圆环病毒1(Porcinecircovirustype1,PCV1)和猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)。通常认为，PCV1不具有致病性，不引起细胞病变，可以制成弱毒疫苗。PCV2具有较强的致病性。PCV2是引起猪圆环病毒病（Porcinecircovirusassociateddisease,PCVAD）的主要病原体。自1998年发现PCV2以来，这种小的、无包膜的环状DNA病毒被认为是全球猪群中最重要的病原体之一，其基因大小只有约疱疹病毒的1％。图1-1参考PMWS(AF027217)基因组序列绘制的PCV2基因组结构图（代振江等，2016）Fig1-1.ThemapofPCV2genomicstructure

要的意义[51-55]。如张福良等以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2（含PCV2ORF2全基因）为标准品，进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线[56]。建立了猪圆环病毒2型的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×1010拷贝/μL，线性范围为109-1010，达10个数量级。该方法的检测灵敏度与套式PCR相当，甚而高于常规PCR，该方法具有较好的特异性和重复性。由于PCR技术的敏感度都较高，而只有PCV2病毒含量达到一定程度，猪才表现出PMWS症状与病变[57]。因此，该方法实施定量测定，为PMWS的预警与诊断起很大作用[58]。图1-2Taqman荧光探针法原理Fig1-2PrincipleofTaqManfluorescentprobemethod

上海师范大学硕士学位论文第三章试剂盒主要生产工艺及反应体系研究293.3结果与分析3.3.1样本冻融次数中浓度样本在-20℃条件下反复冻融1次，3次，5次，7次，9次后，进行核酸提取和qPCR扩增检测，检测如图3-1所示，荧光增长值会随着冻融次数的增多而下降，在冻融超过5次后，荧光增长值会大大降低。从实验结果来看，冻融次数超过5次后对于检测的荧光增长值会减弱到1以下。因此综合考虑建议样本的冻融次数一般不超过5次。图3-1冻融次数试验Fig3-1Numbersoffreeze-thawtests3.3.2样本在2-8℃储存时间的试验不同浓度的样本在2-8℃的存储条件下，在存储0天、1天、2天、3天、4天和5天时分别对不同浓度的样本进行核酸提取和qPCR扩增检测，其平均Ct值变化如表3-4。表3-4不同浓度样本在2-8℃储存时间的Ct值Table3-4Ctvaluesofsamplesofdifferentconcentrationsstoredat2-8℃样本浓度Ct值0天1天2天3天4天5天
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本文编号：2858880