氧化应激相关物质的荧光寿命成像与分子机制研究

发布时间：2020-10-31 14:30

　　 作为细胞内一种常见的生理活动,氧化应激(oxidative stress)一直充当着至为重要的角色。氧化应激被定义为细胞内产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)和抗氧化防御之间平衡中的干扰。随着对于氧化应激的认识不断增长,人们发现其在细胞正常活动中的发挥着重要作用。适量产生的ROS有利于细胞的增殖分化,免疫功能的提升,以及细胞之间的信号传导等。然而,一旦这种氧化应激平衡被打破,例如ROS的爆发,将会逐渐导致严重的氧化损伤,加剧细胞凋亡甚至坏死,从而进一步引发一系列疾病,特别是神经退行性疾病如阿尔兹海默症,帕金森症等与相应的过程密切相关。因此,关于氧化应激相关物质的分析检测是研究这一过程的重要途径,也是进一步探究众多生理与病理过程基础之一。然而,尽管目前越来越多人致力于上述研究,也有很多具有重大意义的发现和突破,但这其中始终面临着固有的挑战:1,细胞内氧化应激相关物质繁多,相互之间联系密切,对于单一物质的检测显然不能满足要求。同时,又由于它们之间的不均匀分布,混合探针难以做到相同位置的精准分析;2,细胞内氧化应激过程主要在线粒体中进行,因此需要进一步开发出能够靶向线粒体探针;3,氧化应激相关的物质浓度处于密切动态变化之中,实时监测相应变化有利于准确地理解整个过程,这就意味着探针必须具有高度选择性的,准确性的检测能力。因此,综上所述,发展出具有能够具有多检测,高选择性,准确度高的单一探针对解析氧化应激过程相关分子动态变化和机制研究具有重大意义!目前已报道多种方法用于此类物质的检测与分析,其中荧光法因具有高时空分辨率,广泛应用于细胞乃至活体内相关物质的成像。相比普通荧光成像技术,荧光寿命成像具有更显著的优势,这是由于荧光成像依赖的信号是荧光强度,容易受到激发光强度,探针浓度以及光漂白的干扰。而荧光寿命成像所展示的是荧光寿命的变化,主要取决于探针响应前后本身性质的改变,与激发光强度,样品浓度等无关,更不会受到光漂白的影响。结合欲解决的关键性问题和能达到的技术优势,本人硕士论文主要开展了以下两个方面的工作:(1)设计并合成单分子靶向线粒体荧光探针(TFP)可用于同时检测神经元线粒体内的过氧化氢(H_2O_2)和三磷酸腺苷(ATP)。该探针具有高度选择性,高准确度响应,而且其对于两种物质的检测之间未发生荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)和交叉干扰,从而进一步实现了神经元线粒体内H_2O_2和ATP的实时荧光寿命成像与定量分析。研究发现线粒体内H_2O_2与ATP联系密切,同时在不同时间的超氧阴离子(O_2~(·–))刺激下,线粒体内两者含量协同变化,而且随着刺激时间的增加,最终导致不可恢复的氧化损伤,诱导神经元死亡。(2)构建DNA四面体荧光纳米探针用于神经元线粒体内pH,次氯酸(HClO),谷胱甘肽(GSH)三物质同时检测。通过将三个对待检测物质特异性响应的分子,以及线粒体靶向分子TPP共同修饰到DNA单链上,最后通过杂交退火形成DNA四面体,以构成整体的复合纳米探针。同时由于DNA链长为12nm,因此三个荧光分子之间并不会发生FRET。另一方面,三个荧光探针的荧光寿命变化区间均能很好地区分开来,可以完成独立的检测。目前只完成了相关体外数据如三种探针的荧光光谱性质,检测的准确性,选择性,以及DNA纳米复合探针的合成。后续工作将主要围绕复合探针对三种物质的同时检测能力,细胞毒性探究,线粒体靶向能力探究,氧化应激状态下神经元成像实验等进行展开。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R318;O657.3
【部分图文】：

华东师范大学硕士学位论文1第1章引言1.1活性氧与氧化应激概述1.1.1活性氧的简介活性氧物质（ReactiveOxygenSpecies，ROS）是一类具有高氧化活性分子。自由基或者离子的总称，这些物质是由细胞新陈代谢过程中由氧分子直接或间接转化而成。其主要包括超氧阴离子自由基（O2–），过氧化氢（H2O2），羟基自由基（OH），次氯酸（HClO），单线态氧（1O2），以及脂质过氧化自由基（ROO）等[1-3]。图1-1.线粒体ROS的产生与转换[4]。线粒体是细胞产生活性氧的主要场所，细胞内90%以上的氧气均在线粒体呼吸链中消耗,其中又约有1%~2%的氧气被转换为ROS[1-4]。具体而言，氧气分子在线粒体呼吸链上得到所泄露的一个电子形成O2–，由于O2–的不稳定性，很容易通过自发突变或者超氧化物歧化酶（SOD）被进一步转换为H2O2（O2–+e-+2H+→H2O2）。接下来，一些金属离子如亚铁离子（Fe2+），亚铜离子（Cu+），进一步和H2O2发生芬顿反应，产生OH（H2O2+Fe2+→OH+OH-+Fe3+;H2O2+Cu+→OH+OH-+Cu2+）。另外，还有部分H2O2会与髓过氧化物（MPO）反应生成HClO。所产生的很多自由基也特别容易与被谷胱甘肽（GSH）所清除，而H2O2则容易被过氧化氢酶（Catalase）或者谷胱甘肽过氧化物酶催化转变为水[1-4]。事实上，这些ROS的转换远不止所叙述的这些，因为细胞内物质太过于繁

华东师范大学硕士学位论文3一些对ROS选择性高，灵敏度高，准确度高，响应速度快的分析方法。本文将从常见的电化学法，表面增强拉曼法，化学发光法，荧光分析法进行详细介绍。1.1.3.1电化学检测法电化学分析法是根据电化学原理和物质在溶液中的电化学性质及其变化而建立起来的一类分析方法。电化学都是将试样溶液以适当的形式作为化学电池的一部分，根据被测组分的电化学性质，将被测定物质的浓度转化为一种电学参量加以测量[19,20]。这些电参量包括电极电势、电流、电阻、电容以及电量等。由于其灵敏度高，准确度高，测量方式多样，仪器设备简单，价格低廉等优点被广泛应用于ROS及其相关物等的分析检测[21-23]。此外，结合微电极，电生理等技术，电化学分析方法可以适用于活体的实时在体分析，无疑进一步推动了整个电化学在检测领域的发展，也为各类生命学研究奠定了厚实基础[20-23]。Zhu[24]等人利用远距离氧化法，在1-十八烷硫醇（ODT）自组装单分子层改性的超疏水金表面上对OH进行了的特异性探测（图1-2）。与铁粉催化的芬顿反应相比，该装置输出的OH速率可以通过紫外光的强度和/或照射时间，TiO2薄膜的表面积和/或厚度等因素来控制，这将有助于量化基底对OH的实际响应量。同时，这也是首次通过电化学阻抗法在光催化体系中建立了一种高效灵敏的OH检测方法，并成功地应用于内霉素（LPS）介导的细胞ROS/RNS爆发过程中OH的检测。该研究不仅为测定与生理和病理过程密切相关的活细胞产生的OH和其他ROS提供了方法学依据，而且为电化学阻抗光谱法检测生物小分子开辟了新的途径。图1-2.ODT自组装单分子层改性的超疏水金表面上对OH检测装置示意图[24]。

华东师范大学硕士学位论文4此外，该课题组还首次利用氨基三乙酸/组氨酸标签物能够促进SOD的电子传递的特点，进一步将相应物质固定在碳电极表面，开发了对O2–检测具有高选择性和灵敏度，低检测限，宽检测区间和良好的重现性等优点的生物传感器，并成功地监测了大鼠脑缺血与再灌注过程中脑内O2–动态变化[25]。此研究为基于氨基三乙酸稳定微电极的ROS体内监测提供了一种新的方法，由此可以获得更多的关于氧化应激和其他生理和病理解析。Hu[26]等人首次利用镀碳纳米电极作为扫描电化学显微镜的尖端穿透活细胞，实时独立测量局部四种ROS/RNS（H2O2，ONOO–，NO2-，NO）的浓度和变化。研究发现，乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞相比展示了大量的ROS与RNS，并且正常细胞在DAG-lactone作用下激活蛋白激酶C（PKC）会引起ROS/RNS的爆发，揭示了PKC与氧化应激之间的联系。此外，该探针还可以检测囊泡等其它亚细胞结构内的ROS/RNS，不仅可以作为一种合适的分析平台，还可以充分早充当期肿瘤的诊断工具。1.1.3.2表面增强拉曼法（surfaceenhancedramanscattering,SERS）SERS依赖于分子吸附到某些粗糙的金属表面如金，银，铜等产生明显增强的拉曼散射，增强因子通常有104~106，由此可以对极低浓度的物质进行检测[27,28]。目前表面增强拉曼主要的增强机理有两种，物理增强和化学增强，基于此人们也研究开发出了一系列具有高增强因子的基底材料用于ROS的检测。图1-3.双仿生功能SERS基底材料用于H2O2检测示意图[29]。Yu[29]等人报告了一种简便，经济，环保的方法，制备出一种新型的双仿生功能（超疏水和过氧化氢酶样活性）SERS基底材料（图1-3）。事实上，他们利
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本文编号：2864071