基于不同定位机制的细胞定位成像研究

发布时间：2020-10-31 15:07

　　 生物体生理和病理的变化机制研究对预防和诊断疾病至关重要。细胞作为生物体基本的结构和功能单位,参与生物体内各种生理过程与变化。监测细胞内各种活性物质的种类、形成过程和细胞内微环境的变化,是研究生理和病理变化机制的基础。但是,由于细胞内分析物的浓度相对较低,因此迫切需要高灵敏度的新型成像工具。传统的成像方式,如计算机断层扫描,磁共振成像和超声检查等,缺乏足够的特异性和敏感性。正电子发射断层扫描灵敏度高,但是这种成像方式受限于严格的放射性化合物使用规定。而光学成像以其无创、实时和高分辨率成像为准确诊断疾病提供了希望。特别是利用小分子荧光技术进行的定位成像,实现了可视化细胞中的特定细胞器乃至整个活细胞,同时也成为了准确预防诊断疾病的有力工具。(1)利用细胞器物理性质监测脂滴的形成过程极性是生命体中的一个重要理化性质,在细胞生理过程的变化中发挥着重要作用。相比蛋白质、核酸和碳水化合物等,脂质结构的极性相对较小。而极性敏感型荧光探针分子可以很好地定位脂质物质。极性敏感型荧光探针在电子激发后,偶极矩会发生明显变化,影响发射波长的位移。通过收集不同波段的光,可以精确的定位不同极性的细胞器。(2)荧光分子与特异性靶向蛋白共价结合实现细胞器的定位成像实现活细胞内对特定蛋白质的实时动态分析是科学家一直探索的问题之一。SNAP-tag无论在体内还是体外都可以通过共价键与苯甲基鸟嘌呤衍生物发生快速特异性反应。当我们利用基因工程在某一细胞器上融合表达SNAP-tag蛋白,通过荧光探针与SNAP-tag蛋白的特异性结合就可以间接将荧光分子紧紧的带入特定的细胞器上,实现细胞器的定位与可视化。(2)基于酶切反应调控荧光信号实现特异性识别肿瘤蛋白酶作为许多疾病的重要诊断生物标志物,在调节各种代谢过程中起重要作用。体内监测蛋白酶对于生物学、医学及相关领域的研究至关重要,特别是在肿瘤中。γ-谷氨酸转移酶(GGT)是在实体瘤中过度表达的最重要的蛋白酶之一。所以准确识别GGT可以精准定位肿瘤。探针由荧光分子通过酰胺键与特定的识别基团相连,不发荧光。但当过量GGT存在的条件下,识别基团可以特异性与GGT反应,切断酰胺键,水解去除底物肽链,释放出荧光分子,发出荧光,实现实时、精准的定位肿瘤组织。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R318;O657.3
【部分图文】：

华东师范大学硕士学位论文4Tang及其同事开发了一种由四苯乙烯（Tetraphenylethene，TPE）和花青（Cyanine，Cy）单元组成的pH比例型探针（TPE-Cy）[22]。该pH探针随着介质逐渐酸化，489nm处的蓝光发射减弱，615nm处的红光发射出现并增强。因此，蓝色荧光强度与红色荧光强度之比反映了介质pH值。根据共聚焦图像中蓝色信号与红色信号比的分布图，可获得HeLa细胞微环境的pH值。图1-1：a为TPE-Cy的结构式，b、c为HeLa细胞共聚焦图像中蓝红光发射比的分布[22]。（2）通过细胞内微环境粘度差异实现定位细胞内粘度在调节信号分子以及短寿命中间体（如活性氮（reactivenitrogenspecies，RNS）和活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS））等的扩散（例如ONOO·及其质子形式的过氧亚硝酸（HOONO）、超氧阴离子自由基、过氧化氢、羟自由基等）中起着至关重要的作用[23,24]。细胞内粘度异常与一系列功能和疾病有关，例如信号转导、动脉粥样硬化、糖尿病等。因此，实现细胞内微环境粘度的定位成像将有助于疾病的诊断[21]。Bottari及其同事报道了一种高度敏感的细胞内粘度探针4-（三苯氨基）-邻苯二甲腈（4-(triphenylamino)-phthalonitrile，TPAP）[25]。随着溶剂粘度的增加，TPAP的旋转逐渐受到限制，荧光强度和寿命得到延长。其旋转动力学受局部粘度调节，并通过可变光谱信号显示出来。如图所示，仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovarycell，CHO）中可观察到强烈的荧光信号。基于探针的荧光强度表明，囊泡的粘度（由白色箭头指示的区域）高于内质网的粘度（紫色箭头）。此

华东师范大学硕士学位论文5外，该探针还可以感应到核（红色箭头）和质膜（黄色箭头）的粘度，两者均显示暗淡的荧光。图1-2：（a）为TPAP的结构式，（b、c）为CHO细胞成像图并通过TPAP检测细胞内粘度。比例尺：（b）10μm，（c）5μm[25]。（3）通过细胞内微环境的极性差异实现定位极性也是细胞微环境一个重要的物理性质。细胞极性对于许多生物学过程至关重要，例如，细胞运动迁移就依赖于细胞的极性化。同时，各细胞器之间极性的差异也是用于区分定位各个细胞器重要的依据。脂滴（Lipiddroplets，LDs）作为一种公认的非极性细胞器，其过度形成导致了肥胖症的出现[21,26]。利用高灵敏度的环境敏感性极性探针实现对LDs的定位成像至关重要。尼罗红（Nilered）是一种商业化的溶剂化变色染料，作为一种敏感的极性探针可对LDs进行染色。Greenspan等发现尼罗红可实现LDs的可视化，并且不会溶解脂质[27]。图1-3为在尼罗红作用下的LDs定位成像图。图1-3：a为尼罗红结构式。（b和c）尼罗红孵育后主动脉平滑肌细胞的共聚焦图片。（d和e）尼罗红孵育后腹膜巨噬细胞的共聚焦图片。（b和d）λex=450-550nm处，λem>528nm；（c和e）λex=515-560nm处，λem>590nm[27]。

华东师范大学硕士学位论文5外，该探针还可以感应到核（红色箭头）和质膜（黄色箭头）的粘度，两者均显示暗淡的荧光。图1-2：（a）为TPAP的结构式，（b、c）为CHO细胞成像图并通过TPAP检测细胞内粘度。比例尺：（b）10μm，（c）5μm[25]。（3）通过细胞内微环境的极性差异实现定位极性也是细胞微环境一个重要的物理性质。细胞极性对于许多生物学过程至关重要，例如，细胞运动迁移就依赖于细胞的极性化。同时，各细胞器之间极性的差异也是用于区分定位各个细胞器重要的依据。脂滴（Lipiddroplets，LDs）作为一种公认的非极性细胞器，其过度形成导致了肥胖症的出现[21,26]。利用高灵敏度的环境敏感性极性探针实现对LDs的定位成像至关重要。尼罗红（Nilered）是一种商业化的溶剂化变色染料，作为一种敏感的极性探针可对LDs进行染色。Greenspan等发现尼罗红可实现LDs的可视化，并且不会溶解脂质[27]。图1-3为在尼罗红作用下的LDs定位成像图。图1-3：a为尼罗红结构式。（b和c）尼罗红孵育后主动脉平滑肌细胞的共聚焦图片。（d和e）尼罗红孵育后腹膜巨噬细胞的共聚焦图片。（b和d）λex=450-550nm处，λem>528nm；（c和e）λex=515-560nm处，λem>590nm[27]。
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本文编号：2864111