纳米铜、纳米氧化铜对两种游仆虫的毒性效应研究

发布时间：2020-11-06 03:59

　　 近年来大量纳米材料广泛运用于各领域,因处理不当流入水体,对水环境生态系统产生一定的影响,纳米材料对水生生物的生态毒理效应已引起科学家的广泛关注。原生动物是一类最原始、最低等、最简单的单细胞真核动物,其细胞膜直接与外界接触,细胞的反应能够及时反映环境变化,常被用作环境指示生物。本研究选择环境中常见的纳米铜和纳米氧化铜(均为30 nm)为实验材料,以淡水小腔游仆虫(Euplotes aediculatus)和海水扇形游仆虫(E.vannus)为受试生物,开展毒理试验,通过光学显微镜和透射电镜技术,应用线粒体、溶酶体荧光染色法和傅里叶红外光谱法,同时测定抗氧化酶活力,即超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化物酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx),以探讨两种纳米材料对两种不同水环境的游仆虫的毒性效应和机制。1.纳米铜、纳米氧化铜对两种游仆虫的毒理试验结果急性毒理结果显示:纳米铜、纳米氧化铜对小腔游仆虫的24 h-LC_(50)分别为0.46μg/L和1.24×10~3μg/L;对扇形游仆虫的6 h-LC_(50)分别为345.32μg/L和1.34×10~6μg/L。慢性毒理结果显示:纳米铜对小腔游仆虫的24 h-EC_(50)、48 h-EC_(50)和72 h-EC_(50)分别为2.10×10~(-3)μg/L、7.92×10~(-4)μg/L、2.77×10~(-4)μg/L;在相同的处理时间内,纳米氧化铜对小腔游仆虫的EC_(50)分别为7.20μg/L、0.86μg/L、0.19μg/L。纳米铜对扇形游仆虫的6 h-EC_(50)、12 h-EC_(50)和18 h-EC_(50)分别为43.32μg/L、6.72μg/L、0.30μg/L;在相同的处理时间内,纳米氧化铜对扇形游仆虫的EC_(50)分别为6.64×10~3μg/L、262.26μg/L、72.13μg/L。与未处理组相比,两种纳米材料不同浓度处理组均可抑制两种游仆虫的生长繁殖,呈剂量依赖型,且纳米铜的抑制作用更强。由此可知,纳米铜毒性强于纳米氧化铜。2.纳米铜、纳米氧化铜对两种游仆虫细胞毒性效应两种游仆虫经过两种纳米材料处理后,运动能力下降,纤毛剧烈抖动,胞内出现空泡并逐渐融合增大,小腔游仆虫细胞体肿胀变形呈球状至破裂;扇形游仆虫细胞体稍有肿胀,内质流出较多,导致裂解死亡。细胞核、线粒体受损程度不一。小腔游仆虫的纳米铜处理组细胞核内染色质凝聚,呈圆形结构,线粒体皱缩呈不规则形状,部分嵴断裂瓦解;而纳米氧化铜处理组细胞核形变较大,核内物质变化不明显,多数线粒体呈不规则形态,少部分肿胀,嵴断裂。扇形游仆虫的纳米铜处理组中细胞核内核仁瓦解消失,染色质凝集,纳米氧化铜处理组细胞核形变,核内可见圆形核仁,染色质凝集成体积不一的不规则团块状结构,前者线粒体肿胀呈圆形或椭圆形,嵴断裂,后者线粒体呈不规则形状,但嵴形态正常。荧光染色结果显示,两种纳米材料对游仆虫的线粒体功能有破坏作用。纳米铜造成的损伤更强,同时产生更多的酸性物质如溶酶体。细胞表膜较完整,但傅里叶红外光谱法测得纳米铜可使两种细胞膜成分的部分官能团(PO_2~-、C-O-C、多糖的δ(COH)等)氧化,而纳米氧化铜对其无明显影响。与对照组相比,两种纳米材料不同浓度处理组均可诱导两种游仆虫体内T-SOD、CAT、GPx酶活力升高,呈剂量依赖型。3.纳米铜、纳米氧化铜对两种游仆虫致毒机理的初步探究两种纳米材料主要通过引起细胞氧化应激反应,损坏抗氧化系统,破坏细胞结构如线粒体、细胞核等多方面使细胞死亡。氧化应激反应及活性氧的产生可能是最主要的致毒机制。细胞内溶酶体及细胞膜成分中被氧化的官能团均预示着细胞对于外界胁迫的抗氧化及防御行为。对于同一种游仆虫,纳米铜的毒性大于纳米氧化铜,且对细胞结构的破坏更严重。这可能因为纳米铜活泼的化学性质、其表面氧化物使细胞产生更多自由基,引起细胞的抗氧化作用,进一步导致细胞结构损伤。本研究结果为纳米材料的细胞毒理学研究补充了新的理论依据。
【学位单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：X171.5
【部分图文】：

华东师范大学硕士学位论文16的纳米材料悬浮液。每6h观察并记录虫体数目，同时添加20μL大肠杆菌菌液，连续观察7d。将所得的数据以实验天数为横坐标，细胞的个数为纵坐标绘制生长曲线图。2.2结果2.2.1纳米材料的表征图1纳米铜（A）和纳米氧化铜（B）在淡水中的表征利用透射电镜表征纳米铜和纳米氧化铜，均呈圆形，平均粒径在30nm左右。两者具有负的zeta电位（-28.18mV，-30.10mV），在溶液中较稳定。表征结果表明，本实验使用的纳米材料适合进行毒性实验。A，C：标尺=50μm。

华东师范大学硕士学位论文17图2纳米铜（A）和纳米氧化铜（B）在海水中的表征透射电镜显示纳米铜和纳米氧化铜在海水中有所聚集，平均粒径变大。两者具有负的zeta电位（-30.37mV，-27.68mV），在溶液中较稳定。A，C：标尺=100μm。2.2.2LC50值的测定本研究利用纳米铜和纳米氧化铜分别对两种游仆虫开展急性毒理实验，结果如下：（1）纳米铜对小腔游仆虫的急性毒理实验回归方程为Y=0.205*X+0.57，R2=0.9856，LC0=1.70×10-3μg/L，LC50=0.46μg/L。（2）纳米氧化铜对小腔游仆虫的急性毒理实验回归方程为Y=0.4184*X-0.794，R2=0.9855，LC0=79.01μg/L，LC50=1.24×103μg/L。（3）纳米铜对扇形游仆虫的急性毒理实验回归方程为Y=0.6867*X-1.243，R2=0.9997，LC0=64.58μg/L，LC50=345.32μg/L。（4）纳米氧化铜对扇形游仆虫的急性毒理实验回归方程为Y=0.887*X-4.936，R2=0.9734，LC0=3.67×105μg/L，LC50=1.34×106μg/L。对于同一种游仆虫（小腔游仆虫或扇

华东师范大学硕士学位论文18形游仆虫），纳米铜处理后，其LC0或者LC50值比纳米氧化铜处理组低，由此可知纳米铜具有更强的致死性（图7，图8）。图3纳米铜对小腔游仆虫24h急性毒理反应浓度对数-死亡率曲线图图4纳米氧化铜对小腔游仆虫24h急性毒理反应浓度对数-死亡率曲线图
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