基于遗传改造发掘深海链霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66的次级代谢产物

发布时间：2020-11-17 21:02

　　 深海链霉菌Streptomyces somaliensis SCSIO ZH66分离自我国南海深度为3536米的海底沉积物之中。深海链霉菌的所处环境十分特殊(如：高盐、高压、低温、低光照、低氧和寡营养),在这种极端环境下它们进化形成了独特的次级代谢途径,从而产生结构类型新颖多样并具有优良活性的次级代谢产物。S.somaliensis SCSIO ZH66的全基因组测序及生物信息学分析结果表明：其基因组大小约为7.1 Mb,由124个连续克隆群组成,推测共包含6312个开放阅读框,预测有16个编码次级代谢产物的生物合成基因簇。本研究采用基因阻断、基因调控及异源表达等策略对深海链霉菌S. somaliensis SCSIO ZH66进行了基因组采掘研究。主要获得了以下结果：第一,对新颖的非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)生物合成基因簇nrps-3进行了生物信息学分析,预测其可能编码一类糖基化或甲基化的结构新颖的天然产物；对其中非核糖体肽合酶基因orf7和orf8进一步分析,推测编码产物由6个氨基酸前体形成。基因双交换阻断突变株Δorf8发酵产物的HPLC指纹图谱分析结果表明,其次级代谢产物相比于野生型菌株有明显的差异。随后对突变株Δorf8进行了大规模发酵,样品经过C18反相开放柱得到了15个组分。多重耐药菌(multi-drug resistant. MDR)抑制活性实验结果表明突变株与野生株所产生的差异峰所在组分Fr. 6具有明显的MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus)抑制活性。进而对Fr.6中的差异峰进行了分离纯化得到了5个化合物,并通过HRMS和NMR分析确定了它们的结构,分别为violapyrones A-C、H和I。其中violapyrone B的MRSA抑制活性为：100μg样品对MRSA的抑菌圈直径为25 mm。此研究结果表明,nrps-3基因簇中orf8基因的阻断未检测到nrps-3基因簇的编码产物,但使突变株积累了violapyrones类化合物。第二,多效调控基因regP12在S. somaliensis SCSIO ZH66中的异源表达研究。将来源于另外一株海洋链霉菌Streptomyces sp. OUC6819的多效调控基因regP12置于组成型表达启动子gapDHp之下构建成表达载体,然后采用接合转移方法导入S. somaliensis SCSIO ZH66之中,获得重组菌株ZH66/pMT3::regP12。重组菌株发酵产物的HPLC分析结果表明,与野生株相比,重组菌株的次级代谢产物发生了明显变化,产生了3个新的化合物峰,同时丧失了2个violapyrones类化合物的产生能力。此结果表明,异源多效调控基因regP12对S. somaliensis SCSIO ZH66的次级代谢表现出调控功能,为下一步从中分离新颖结构化合物奠定了基础。
【学位单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q936
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 海洋放线菌
    1.2 海洋放线菌产生的次级代谢产物
        1.2.1 生物碱
        1.2.2 萜类
        1.2.3 大环内酯类
        1.2.4 环肽
        1.2.5 醌类
    1.3 海洋放线菌非核糖体肽合成酶生物合成途径研究进展
        1.3.1 非核糖体肽（NRPS）合成酶以及合成途径
        1.3.2 海洋放线菌NRPS生物合成途径的研究
    1.4 放线菌基因组以及基因组采掘
        1.4.1 放线菌基因组
        1.4.2 放线菌基因组采掘
        1.4.3 海洋放线菌基因采掘
    1.5 促使放线菌基因簇表达的方法
        1.5.1 优化培养条件
        1.5.2 操作转录调节基因
        1.5.3 基因敲除
        1.5.4 异源表达
    1.6 本文研究的目的和意义
第二章 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 实验质粒和载体
        2.1.3 实验引物
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 实验试剂
        2.1.6 培养基与抗生素
        2.1.7 实验所用的抗生素
        2.1.8 缓冲液
    2.2 实验方法
        2.2.1 菌种保藏
        2.2.2 大肠杆菌质粒的快速提取
        2.2.3 碱裂解法质粒提取
        2.2.4 酸酚法提质粒
        2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.6 总DNA提取
        2.2.7 PCR片段酚抽浓缩
        2.2.8 胶回收（试剂盒）
        2.2.9 接合转移
        2.2.10 感受态的制备、电转
        2.2.11 酶切、链接反应
        2.2.12 目的基因扩增
        2.2.13 基因组文库的筛选
        2.2.14 菌株活化
        2.2.15 菌体发酵培养
        2.2.16 发酵液处理
        2.2.17 发酵液样品HPLC条件
        2.2.18 发酵样品分离纯化条件
        2.2.19 样品TLC分析
        2.2.20 发酵浸膏样品液液萃取
        2.2.21 样品正相硅胶柱分离纯化（干法上样）
        2.2.22 样品开放柱柱分离纯化（湿法上样）
        2.2.23 多重耐药菌抑菌实验
        2.2.24 序列分析网站
        2.2.25 其他
第三章 深海链霉菌S. somaliensis SCSIO ZH66中nrps-3生物合成基因簇的研究
    3.1 引言
    3.2 实验结果
        3.2.1 S.somaliensis SCSIO ZH66中nrps-3基因簇的生物信息学分析
        3.2.2 突变株Δorf8发酵产物的HPLC分析
        3.2.3 突变株Δorf8的大规模发酵
        3.2.4 突变株Δorf8发酵产物的分离纯化
        3.2.5 化合物的结构鉴定
        3.2.6 化合物violapyrone B的MDR菌抑制活性实验
    3.3 本章小结
第四章 多效调控基因regP12在链霉菌S somaliensis SCSIO ZH66中异源表达研究
    4.2 引言
        4.2.1 Streptomyces sp.OUC6819中regP12基因生物信息学分析
        4.2.2 重组质粒的构建
        4.2.3 重组菌株的构建
        4.2.4 重组菌株发酵样品HPLC分析
        4.2.5 重组菌株差异峰的初步研究
    4.3 本章小结
第五章 结语与展望
    5.1 结语
    5.2 未来工作展望
参考文献
致谢
符号简写
个人简历

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本文编号：2887911