土壤反硝化微生物对多环芳烃污染响应的研究

发布时间：2020-11-18 21:24

　　 多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是一种由2个或2个以上苯环以线状、角状或簇状组成的烃类化合物,因其具有强烈的致癌、致畸、致突变作用,对环境和人类健康造成较大危害。微生物去除PAHs具有快速、低价、无二次污染等优点,是土壤PAHs去除的主要途径。硝酸盐具有较高的氧化还原电势,即可以为土壤微生物生长提供所必须的氮源,又可以作为土壤反硝化微生物的电子受体。土壤中的反硝化微生物在70多个属中均有分布,且早有研究表明,土壤中PAHs的降解可以与反硝化细菌所驱动的反硝化过程相偶联,但目前土壤反硝化微生物对PAHs污染的响应机制还少有报道。因此,本研究以具有50多年历史的江汉油田区域土壤为研究对象,从该油田的油井口附近采集9个土壤样品,编号为JH-1至JH-9,测定各土壤样品的基本理化性质及PAHs含量的同时,以反硝化功能基因narG(硝酸盐还原酶基因)、nirK(Cu-亚硝酸还原酶基因)和nirS(细胞色素cd1-亚硝酸还原酶基因)为分子标识,通过荧光定量-PCR和限制性末端片段长度多态性分析(terminal-restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)的方法来检测各样品中反硝化相关功能基因的丰度及群落结构,进而探讨土壤反硝化微生物对土壤环境因子及PAHs含量的响应机制。随后,通过厌氧微宇宙培养实验进一步研究反硝化细菌活性与丰度对典型PAHs(芘)污染的响应,并通过Illumina Miseq测序的方法研究添加硝酸盐和芘对土壤细菌群落结构的影响。全面探讨土壤反硝化细菌对PAHs污染的响应机理,以期为进一步深入探究PAHs污染与土壤反硝化过程的相互关系打下基础。主要研究结果如下:1)江汉油田区直接采集的农田土壤样品的调查结果表明,土壤PAHs含量在0.21~8.10mg·kg-1之间,污染程度较低。定量-PCR的结果表明,PAHs含量最高的土壤样品(JH-4)中反硝化功能基因narG的丰度也最高,相关性分析表明,该油田区土壤中narG型微生物丰度与土壤PAHs含量成正相关关系(R2=0.58,P0.05);与此相反,PAHs含量最高的土壤样品(JH-4)中反硝化功能基因nirK和nirS的丰度均最低,相关性分析表明,土壤nirK及nirS基因的丰度均与土壤PAHs含量呈显著负相关(nirK:R2=0.54,P0.05;nirS:R2=0.58,P0.05)。克隆文库及T-RFLP的结果则表明,该油田土壤中nirK基因的群落组成在不同样品间的变异较大,且PAHs含量最高的JH-4中该基因的群落组成与其它各样品有明显的不同,冗余分析(redundancy analysis,RDA)的结果进一步表明除有效氮、有效磷外,土壤PAHs含量也是影响nirK型反硝化微生物群落组成的重要因子。相较于nirK,该油田区土壤中nirS基因的群落组成在不同样品间的差异较小,但发现nirS型假单胞菌的丰度与土壤PAHs含量呈正相关,表明具备较强有机污染物降解能力的假单胞菌属可能在该区域土壤PAHs的反硝化代谢中起到重要作用。2)在研究内容1的基础上,选择一个相对干净的土壤样品(JH-9)作为研究对象,通过添加硝酸盐和芘(典型的4环PAHs,常被作为检测PAHs污染的指示物和其它PAHs生物降解的模型分子)的微宇宙培养实验,进一步研究土壤反硝化细菌的丰度和活性对PAHs污染的响应。本实验设置添加30 mg·kg-1硝酸盐(N30)和不加硝酸盐(N0)两个处理,每个处理包含3个不同的芘浓度(0,30,60 mg·kg-1,分别用P0,P30,P60表示),共6个处理,分别用N0P0,N0P30,N0P60,N30P0,N30P30和N30P60表示,在厌氧条件下培养45天,并在培养第3,14,28,45天取样测量土壤的PAHs含量,N2O,CO2产生速率和相关反硝化功能基因丰度。实验结果表明,培养后期(45天),土壤中芘的总降解率在26.14%~43.03%之间,且芘的初始浓度越高,其降解率也越高,但在厌氧培养过程中硝酸盐的添加对芘的降解无显著影响。此外,对土壤N2O产生速率的研究表明,各样品只在培养初期(3天)检测到N2O的释放,其含量在122.82~379.22μg·kg-1·h-1之间,且硝酸盐的添加对土壤N2O的产生速率有显著的促进作用。对微生物活性的测定表明,在培养第3,7和14天的CO2产生速率在各处理土壤间无显著差别,但在培养后期(45天),添加硝酸盐的处理中CO2的产生速率显著高于未添加硝酸盐的处理。此外,定量PCR的结果表明,在培养过程中,反硝化相关基因的丰度呈现先降低后升高的趋势,但硝酸盐和芘的添加对反硝化功能基因的丰度无显著影响。3)为了进一步研究厌氧条件下添加硝酸盐和芘对细菌群落结构的影响,在研究2的基础上,选择微宇宙培养45天的4个代表性土壤处理((N0P0、N0P60、N30P0、N30P60),通过Illumina miseq测序技术解析土壤样品中的细菌群落结构。结果表明,添加硝酸盐和芘的处理中土壤的多样性指数(Chao1,shannon)均略高于未添加硝酸盐和芘的处理N0P0。在门水平上对微生物群落组成分析发现,Actinobacteria(放线菌门)、Bacteroidetes(拟杆菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)和Proteobacteria(变形菌门)细菌为本研究土壤的优势细菌类群。进一步分析发现,未添加硝酸盐的处理(N0P0、N0P60)有相似的细菌群落组成,但与添加硝酸盐的处理各细菌门在丰度存在明显不同。与不添加硝酸盐的处理相比,添加硝酸盐使放线菌门的细菌丰度显著减少,而变形菌门细菌的丰度增加。对放线菌门和变形菌门细菌在属水平的进一步分析发现,这4个处理在变形菌门和放线菌门属水平上具有相同的细菌种类,但是添加硝酸盐和未添加硝酸盐的处理在各细菌属的比例上却有显著差异。由此可见,在厌氧条件下,芘对微生物群落结构无显著影响,但硝酸盐是影响微生物群落结构的重要因素。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：X53;S154.3
【部分图文】：

第 1 章 文献综述硝化过程化作用是氮循环里的一个重要环节，和硝化作用以及生物固氮等作用共同素的循环。反硝化作用又称脱氮作用，是指反硝化微生物在一定条件下，逐步还原，最终将氮以一氧化氮（NO）、氧化亚氮（N2O）或分子态氮（N的过程。细菌的反硝化过程如图 1-1 所示，该过程是由一系列酶催化反应发分别是硝酸盐还原酶（nitrate reductase, Nar）、亚硝酸盐还原酶（nitrite reduc还原酶（nitric oxidereductase, Nor）和氧化亚氮还原酶（nitrous oxide reducpot et al., 2002a），这些酶通常是在厌氧条件下被顺序诱导产生。总体来说，示为以下还原反应：2NO3 +10e-+12H+→N2+6H2O（Tavares et al., 2006）。

物关系的研究还不多见。因此，本研究选择具有 50 多年历史的江汉油田区域农田土壤为研对象，以反硝化的功能基因 narG、nirK 及 nirS 为分子标识，利用定量-PCR 及克隆文库结T-RFLP 的方法，来探讨该油田区域土壤 PAHs 含量等环境因子与反硝化微生物群落结构之的关系，可为进一步深入研究土壤 PAHs 反硝化降解的微生物机理提供一定的理论依据。3.1 材料与方法3.1.1 土壤样品的采集江汉油田位于湖北省的潜江市（112°29′E~113°01′E，30°04′N~30°49′N）境内，已有 5年的油气开发历史，是新中国最早开发的油气田之一。本研究的土壤样品在 2014 年 7 月采于江汉油田区域不同出油井附近的农田表层（0~20 cm），以水稻-油菜轮作形式耕种。共选了九个采样点，编号为 JH-1~JH-9，在每个采样点中心周围 30 m2的范围内，随机选择 9 个进行多点混合并初步剔除石块和杂物，以完成单个土样的采集，每个样品设置 3 次重复，体采样点的地理信息如下图 3-1 所示。采集好的样品装于自封袋后，置于放有冰袋的箱子中回实验室。随后，过 2 mm 筛后分装，部分保存于 4 ℃用于基本性质测定，部分置于-20 ℃箱用于 DNA 的提取，剩余部分风干后用于有机质等的测定。

图 3-2a 土壤 narG 基因克隆文库验证的 PCR 电泳图Pig 3-2a The PCR electrophoregram of soil narG gene cloning library validation图 3-2b 土壤 nirK 基因克隆文库验证的 PCR 电泳图Pig 3-2b The PCR electrophoregram of soil nirK gene cloning library validation
【参考文献】

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本文编号：2889217