脂筏在肠道病毒D68型感染中的作用及机制研究

发布时间：2020-11-19 13:10

　　 肠道病毒D68型(EV-D68)属小核糖核酸病毒科肠道病毒属,属于无包膜的单股正链RNA病毒。1962年从加利福尼亚儿童咽拭子中首次分离,可引起神经系统疾病及儿童呼吸系统疾病,并且呼吸系统疾病在临床更为常见。近年来,EV-D68在全世界的多个国家或地区爆发,目前并无特效药物及疫苗。脂筏(lipid raft)位于细胞膜上,其中成份包括丰富的鞘磷脂与胆固醇,并且较为广泛的分布于细胞的膜系统。在细胞内外因素的影响下,脂筏可动态性和选择性地募集宿主蛋白,参与细胞的多种生物学功能。包膜病毒在感染宿主细胞时,首先通过其包膜与宿主细胞的细胞膜进行融合,从而将病毒基因组释放至宿主细胞内。病毒将通过表面的糖蛋白分子与细胞膜上的蛋白受体结合并且在受体的介导下以内吞的方式进入细胞,而脂筏在多种病毒如HIV-1、流感病毒和人类疱疹病毒-6(human herps virus 6,HHV-6)等的侵入、装配和释放过程中起重要作用。病毒在与宿主细胞膜受体结合的同时也会激活与受体偶联的相关细胞信号分子,从而激活相关的信号通路参与宿主细胞的各种生理过程,而且有些病毒就是通过脂筏来参与相关的信号传导。关于脂筏在EV-D68感染中的作用,尚未见相关文献报道。为探讨脂筏在EV-D68感染细胞中的作用,并最终为阐明EV-D68致病的分子机理及寻找新的抗病毒靶点提供依据,我们完成了如下研究。一、用甲基-β-环糊精(methyl-β-cyclodextrin,MβCD)去除部分维持脂筏稳定性的胆固醇分子来破坏宿主细胞膜脂筏结构,可抑制EV-D68进入并使病毒滴度降低;而在病毒进入过程中补充外源胆固醇可逆转MβCD去除细胞膜胆固醇对EV-D68进入的抑制作用,表明脂筏与EV-D68的进入和复制密切相关。二、使用qRT-PCR检测脂筏对病毒吸附和进入的影响,发现破坏脂筏抑制病毒的进入作用,并且在补充外源胆固醇后病毒的进入作用有所恢复。三、应用Western blot检测提取的脂筏组分,发现EV-D68与脂筏标志蛋白有共同定位,证明EV-D68可以通过脂筏结构进入细胞。四、MβCD可将细胞脂筏组分驱散,其标志蛋白、病毒以及非脂筏区域标志蛋白有共同定位,说明EV-D68将通过非脂筏区域进入细胞。五、共聚焦显微镜方法检测到使用MβCD处理细胞后,病毒进入过程中内吞小泡的酸化受到影响。六、破坏脂筏抑制EV-D68流行株的感染。综上,本研究发现脂筏参与EV-D68的进入及内吞小泡的酸化,破坏脂筏后内吞小泡的形成可能受到影响,干扰病毒基因组的释放,从而干扰病毒生命周期,而破坏脂筏后EV-D68通过非脂筏区域进入细胞。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：R373.2
【部分图文】：

第1章绪论1第1章绪论1.1肠道病毒D68型的研究进展肠道病毒D68型（EV-D68）属小核糖核酸病毒科，1962年首次从加州儿童口咽拭子中分离和鉴定[1]，并确定了四种不同的病毒株：Fermon,Franklin,Robison,andRhyne。近年来，新的代表性毒株逐渐出现，例如US/MO/14-18947（MO），US/KY/14-18953（KY）等。EV-D68主要引起神经系统疾病以及儿童的呼吸系统疾病，并且呼吸系统疾病在临床最为常见[3,4,7,8]。以前有关EV-D68感染的相关报道很少，但自2005年以来，它在美国、亚洲和欧洲经历了全球性的爆发，在过去的15年中发病率不断增加，并且威胁到全球公共卫生安全[2,6,9,11]。1.1.1EV-D68基因组结构EV-D68的基因组包含约7.6kb的单正链RNA。EV-D68包含一个单一的开放阅读框（ORF），其两端分别带有非翻译区（UTR）[5]，编码一种前体蛋白，并且可进一步自动催化裂解产生四种结构蛋白（VP1，VP2，VP3和VP4）和七种非结构蛋白（2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D）（图1）[5]。图1.肠道病毒D68基因组的示意图。1.1.2EV-D68的感染机制病毒是一种必须在活细胞内才能生存的微生物，在进入细胞前必须通过与细胞表面的受体蛋白结合，随后在受体蛋白的介导下进入细胞。有研究表明，唾液酸（SialicAcid）可能是EV-D68的受体蛋白[12,15,18]。研究人员通过使用神经氨酸酶（NA）处理HeLa细胞经后仅有约10%的EV-D68吸附在细胞表面，

第 3 章 实验结果与讨论 第 3 章 实验结果与讨论 3.1 药物使用浓度的确定 通过 MTS 实验确定甲基-β-环糊精（MβCD）对细胞的毒性浓度。使用 10mM MβCD 可将胆固醇成分降低至 35%，可有效破坏脂筏结构[29]。结合 MTS 实验结果确定使用药物使用浓度范围为 0mM-10mM（图 3.1）。

脂筏结构对EV-D68感染性的影响检测Fig.3.2DetectionoftheeffectoflipidraftstructureonEV-D68
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本文编号：2890051