nirS型反硝化细菌的系统进化以及在珠江口的生态分布特征
发布时间：2020-12-19 06:07
随着沿海地区人口密度的逐年增多及现代化工业的发展,大量的工农业废水和生活污水被排入到了海洋,从而导致过量的活性氮也从陆地向水体迁移,这种现象成为了河口富营养化的主要原因,由此引起了一系列的环境危害。反硝化作用是微生物介导的氮循环中的一个重要过程,对河口沉积物中过量氮素的去除有着非常重要的意义。作用于反硝化过程的微生物称为反硝化菌,其中反硝化细菌种类繁多,分布广泛,所以常规的16S rRNA测序法并不能被用于研究其生态学特性。本研究采用nirS基因作为分子标记来研究反硝化细菌的多样性,分别在2016年冬天和夏天沿着珠江口（Pearl River Estuary,PRE）主流的5个站位进行了采样,从上游到下游分别是PRE-1、PRE-3、PRE-7、PRE-13和PRE-18,每个站位包括表层,中层和底层,共计30个采样点。我们分别使用15N标记的同位素示踪测定法、实时定量pcr和高通量测序技术分析了珠江口沉积物中nirS型反硝化细菌的活性、丰度、多样性、群落结构以及对环境因子的响应,具体研究结果如下:1.通过分别计算反硝化功能基因与16S rRNA基因的相似性阈值,...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
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【学位级别】：硕士
【部分图文】：
自然界微生物氮循环示意图
内蒙古大学硕士学位论文7图1.2Cu-NIRs的三聚体结构及其单体（Admanetal.,1995;Horrelletal.,2017）Figure1.2DomainandoligomericstructureofCu-NIRs注：紫色代表T1Cu；绿色代表T2CuNote:ThepurpleisT1Cu;thegreenisT2Cu1.3.2含cd1型的亚硝酸盐还原酶细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶（cd1-NIRs）是一种分子量为20kD的二聚体，有细胞色素c和d1两种类型，且由nirS基因所编码[50]。它和铜型亚硝酸盐还原酶催化的产物都是气体一氧化氮，同时伴随少量的一氧化二氮气体。NirS基因在反硝化过程中是极为重要的一个功能基因，除此之外还是反硝化细菌分析环境中反硝化细菌多样性的重要的一个靶基因[51]。所以，研究由nirS基因编码的酶（细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶）的生物细胞和分子学基础就显得尤为重要。细胞色素cd1型和铜型亚硝酸盐还原酶的功能相同但是结构及催化位点却不相同。大多数研究报道的反硝化细菌含有cd1型，但也有很多研究证实了含铜型的反硝化细菌基因存在于更多的细菌类别中[52]。Cd1-NIRs是由Radoul等人从Pseudomonasaeruginosa中分离出来的[53]。Cd1-NIRs是一种能够将亚硝酸盐催化成一氧化氮的同株异核生殖蛋白，具有可溶性。它包含两个具有60kD重的亚基二聚体，其中每一个亚基均含有1个共价的Hc和1个Hd1，而Hc分别具有His-17和His-69两个轴向的His配体，Hd1和Hc被His-200与Tyr-25连接起来，其中Hd1不仅仅是单核的铁中心，也是亚硝酸盐还原的催化活性中心。Hd1位于其中的一个二聚体中，而Hc位于另一个二聚体中，它们之间是需要通过转移电子来进行催化反应的[54]。含有cd1-NIRs的菌株是利用亚硝酸根离子或氧气等化合物来进行呼吸的。此外，Cd1-NIRs不仅是一个能将亚硝酸盐还原成一氧化氮的还原酶，它还是具有另外一种催化功?
第1章引言8和cd1-NIRs这两类亚硝酸盐还原酶不会同时出现在同一菌株中[56]。含细胞色素cd1型的在细菌中的分布较含铜型的更广泛。在纯菌株中，含铜型的菌株占的比例更大，但研究显示来自富氧土地的反硝化菌株里很多都含有细胞色素cd1型，但是也不能排除含有Cu-NIRs的细菌，只是目前尚未发现或者是已经发现但是还未被鉴定[57]。如图1.3所示。图1.3Cd1-NIRs的立体结构[错误！未定义书签。]Figure1.3Three-dimensionalstructureofcd1-NIRs1.4反硝化细菌的分子生态学研究分析功能基因的多样性不仅有助于理解不同环境中的生物地球化学循环过程，而且也可以研究基因间系统进化关系[58]。所以，功能基因特异性引物的发现是研究环境中反硝化细菌的多样性的第一步。在1998年，经过反复试验，Braker等人[59]研究出了扩增两种功能基因（nirS和nirK）特异性片段的引物并且还通过PCR将nirK基因和nirS基因扩增出来，其中nirK基因是从Alcaligenessp.DSM30128、Alcaligenesxylosoxidans和Blastobacterdenitrificans扩增得到的。这对于分子生物技术以及分子生态学的发展来说，是一个新的里程碑。与此同时，编码硝酸盐还原酶的napA基因、编码一氧化氮还原酶的两类基因norB、norC以及编码一氧化二氮还原酶的nosZ基因也先后被应用到分子生物学和分子生态学中，这打破了传递培养的分析方法，使得反硝化细菌的丰度、多样性和群落结构在自然环境中逐步得到了研究，但是为了更准确地检测环境中反硝化细菌的丰度和多样性，也可以使传统的分子培养和生物学方法相结合。研究表明[60]，反硝化细菌更喜欢分布在海洋低氧区、稻田、土壤甚至沉积物等生境中，在这些生境中的反硝化细菌功能基因具有很高的多样性。而且通过分子生物学技术还可发现很多新的反硝化菌种
【参考文献】：
期刊论文
[1]土壤nirS、nosZ型反硝化菌群落结构及多样性对牛场肥水灌溉水平的响应[J]. 高文萱,闫建华,杜会英,张克强. 农业环境科学学报. 2019(05)
[2]硫自养与异养混合亚硝酸盐反硝化过程铵生成机制[J]. 刘双,赵剑强,王莎,兰兰,李晓玲,芦昭霖. 环境工程学报. 2019(06)
[3]宏基因组来源β-半乳糖苷酶的异源表达与酶学性质研究[J]. 杨正凤,杨雁霞,张文洪,黄吉芬,黄遵锡,许波. 云南师范大学学报(自然科学版). 2018(04)
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[5]小鼠Prune蛋白DHH结构域的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 陆翮,高子昭,康健,许艳慧,宁唤唤,柏银兰. 生物技术. 2018(03)
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[7]非共生生物固氮微生物分子生态学研究进展[J]. 徐鹏霞,韩丽丽,贺纪正,罗锋,张丽梅. 应用生态学报. 2017(10)
[8]分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展[J]. 姬洪飞,王颖. 生态学报. 2016(24)
[9]滇池沉积物中厌氧氨氧化细菌分布的时空差异[J]. 陈泽斌,夏体渊,王定康,徐胜光,何峰,任稹. 水生生物学报. 2016(02)
[10]大庆龙凤湿地nirS基因型反硝化细菌生物多样性初探[J]. 张营,肖翠红,邹德华,曹俊杰,李可. 黑龙江科技信息. 2014(26)
博士论文
[1]水源水库中好氧反硝化菌的筛选及脱氮性能研究[D]. 郭琳.西安建筑科技大学 2015
硕士论文
[1]短程硝化—厌氧氨氧化—反硝化耦合（SNAD）-SBR组合工艺处理大豆蛋白废水的试验研究[D]. 苏佳亮.北京交通大学 2015
[2]名山区茶园生态系统施肥管理对氮循环平衡的影响[D]. 宁睿婷.四川农业大学 2014
[3]渤海沉积环境硝化过程氨氧化细菌的研究[D]. 田方.中国石油大学（华东） 2012
[4]16S rRNA/rDNA序列分析技术应用于环境微生物群落的初步研究[D]. 肖勇.湖南大学 2007
本文编号：2925398
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
自然界微生物氮循环示意图
内蒙古大学硕士学位论文7图1.2Cu-NIRs的三聚体结构及其单体（Admanetal.,1995;Horrelletal.,2017）Figure1.2DomainandoligomericstructureofCu-NIRs注：紫色代表T1Cu；绿色代表T2CuNote:ThepurpleisT1Cu;thegreenisT2Cu1.3.2含cd1型的亚硝酸盐还原酶细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶（cd1-NIRs）是一种分子量为20kD的二聚体，有细胞色素c和d1两种类型，且由nirS基因所编码[50]。它和铜型亚硝酸盐还原酶催化的产物都是气体一氧化氮，同时伴随少量的一氧化二氮气体。NirS基因在反硝化过程中是极为重要的一个功能基因，除此之外还是反硝化细菌分析环境中反硝化细菌多样性的重要的一个靶基因[51]。所以，研究由nirS基因编码的酶（细胞色素cd1型亚硝酸盐还原酶）的生物细胞和分子学基础就显得尤为重要。细胞色素cd1型和铜型亚硝酸盐还原酶的功能相同但是结构及催化位点却不相同。大多数研究报道的反硝化细菌含有cd1型，但也有很多研究证实了含铜型的反硝化细菌基因存在于更多的细菌类别中[52]。Cd1-NIRs是由Radoul等人从Pseudomonasaeruginosa中分离出来的[53]。Cd1-NIRs是一种能够将亚硝酸盐催化成一氧化氮的同株异核生殖蛋白，具有可溶性。它包含两个具有60kD重的亚基二聚体，其中每一个亚基均含有1个共价的Hc和1个Hd1，而Hc分别具有His-17和His-69两个轴向的His配体，Hd1和Hc被His-200与Tyr-25连接起来，其中Hd1不仅仅是单核的铁中心，也是亚硝酸盐还原的催化活性中心。Hd1位于其中的一个二聚体中，而Hc位于另一个二聚体中，它们之间是需要通过转移电子来进行催化反应的[54]。含有cd1-NIRs的菌株是利用亚硝酸根离子或氧气等化合物来进行呼吸的。此外，Cd1-NIRs不仅是一个能将亚硝酸盐还原成一氧化氮的还原酶，它还是具有另外一种催化功?
第1章引言8和cd1-NIRs这两类亚硝酸盐还原酶不会同时出现在同一菌株中[56]。含细胞色素cd1型的在细菌中的分布较含铜型的更广泛。在纯菌株中，含铜型的菌株占的比例更大，但研究显示来自富氧土地的反硝化菌株里很多都含有细胞色素cd1型，但是也不能排除含有Cu-NIRs的细菌，只是目前尚未发现或者是已经发现但是还未被鉴定[57]。如图1.3所示。图1.3Cd1-NIRs的立体结构[错误！未定义书签。]Figure1.3Three-dimensionalstructureofcd1-NIRs1.4反硝化细菌的分子生态学研究分析功能基因的多样性不仅有助于理解不同环境中的生物地球化学循环过程，而且也可以研究基因间系统进化关系[58]。所以，功能基因特异性引物的发现是研究环境中反硝化细菌的多样性的第一步。在1998年，经过反复试验，Braker等人[59]研究出了扩增两种功能基因（nirS和nirK）特异性片段的引物并且还通过PCR将nirK基因和nirS基因扩增出来，其中nirK基因是从Alcaligenessp.DSM30128、Alcaligenesxylosoxidans和Blastobacterdenitrificans扩增得到的。这对于分子生物技术以及分子生态学的发展来说，是一个新的里程碑。与此同时，编码硝酸盐还原酶的napA基因、编码一氧化氮还原酶的两类基因norB、norC以及编码一氧化二氮还原酶的nosZ基因也先后被应用到分子生物学和分子生态学中，这打破了传递培养的分析方法，使得反硝化细菌的丰度、多样性和群落结构在自然环境中逐步得到了研究，但是为了更准确地检测环境中反硝化细菌的丰度和多样性，也可以使传统的分子培养和生物学方法相结合。研究表明[60]，反硝化细菌更喜欢分布在海洋低氧区、稻田、土壤甚至沉积物等生境中，在这些生境中的反硝化细菌功能基因具有很高的多样性。而且通过分子生物学技术还可发现很多新的反硝化菌种
【参考文献】：
期刊论文
[1]土壤nirS、nosZ型反硝化菌群落结构及多样性对牛场肥水灌溉水平的响应[J]. 高文萱,闫建华,杜会英,张克强. 农业环境科学学报. 2019(05)
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[8]分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展[J]. 姬洪飞,王颖. 生态学报. 2016(24)
[9]滇池沉积物中厌氧氨氧化细菌分布的时空差异[J]. 陈泽斌,夏体渊,王定康,徐胜光,何峰,任稹. 水生生物学报. 2016(02)
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博士论文
[1]水源水库中好氧反硝化菌的筛选及脱氮性能研究[D]. 郭琳.西安建筑科技大学 2015
硕士论文
[1]短程硝化—厌氧氨氧化—反硝化耦合（SNAD）-SBR组合工艺处理大豆蛋白废水的试验研究[D]. 苏佳亮.北京交通大学 2015
[2]名山区茶园生态系统施肥管理对氮循环平衡的影响[D]. 宁睿婷.四川农业大学 2014
[3]渤海沉积环境硝化过程氨氧化细菌的研究[D]. 田方.中国石油大学（华东） 2012
[4]16S rRNA/rDNA序列分析技术应用于环境微生物群落的初步研究[D]. 肖勇.湖南大学 2007
本文编号：2925398
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