胍盐离子液体修饰的磁性纳米材料纯化生物样品中的DNA
发布时间：2020-12-19 06:30
基于DNA的分析是众多生物应用的基础,然而,从环境基质中或者生物样品中分离出高纯度的DNA是复杂且富有挑战性的。传统的DNA提取技术是采用酚-氯仿液液萃取,但该方法需要使用大量的有机溶剂,对人体健康有害。源自固相萃取技术的磁性固相萃取技术现已在DNA纯化中得到应用,磁性固相萃取集分离富集为一体,省去离心步骤,具有操作简便,回收重复利用率高,能实现自动化等优点。本研究基于磁性固相萃取技术,制备了11种由不同胍盐离子液体修饰的磁性壳聚糖-氧化石墨烯（Guanidinium ionic liquid modified-magnetic chitosan/graphene oxide,GIL-MCGO）复合纳米材料,将其作为磁性吸附剂结合磁固相萃取技术,对DNA进行了纯化分离。这些GIL-MCGO的直径约为20纳米,通过一块普通的磁铁,GIL-MCGO即可对单链DNA及鲑鱼精子DNA钠盐进行快速纯化富集。本研究采用NanoDrop 2000分光光度计对所制备的11种GIL-MCGO的DNA提取率进行了评估。通过单因素实验系统的研究了可能影响DNA提取的相关因素,如pH值、温度、提取时间和离子强...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
磁性固相萃取流程图
硕士学位论文10图1-2胍盐离子液体的化学结构1.3.2胍盐离子液体的性质1.3.2.1热稳定性和化学稳定性由于胍盐阳离子含有三个氮原子能与其中心的碳原子共轭，因此具有高热稳定性和化学稳定性。而胍盐离子液体的热失重温度与其阴、阳离子的组成相关，除了少数酸性和硝酸盐胍盐离子液体热失重的温度较低，其他胍盐离子液体的热分解温度大约在200-353℃之间[66]。通过利用胍盐的热稳定性和化学稳定性，胍盐离子液体已经被用作高温条件下的一种催化剂[62]。1.3.2.2熔点低熔点的离子液体具有：阳离子低对称性、弱分子间作用力、离子电荷分布均匀[67,68]。胍盐离子液体所含阴、阳离子的种类和结构影响着其熔点的高低。由于胍盐阳离子具有三个氮原子能与中心碳原子形成共轭，正电荷分布在中心碳原子和三个氮原子上，使得不对称烷基取代的胍盐具有较低的熔点。有研究发现，对于胍盐离子液体的Tm/Tg值而言：环状化合物＞链状化合物，含氧化合物＞不含氧化合物；链状胍盐的熔点随着烷基的大小而降低，如：正己基＞正丁基＞正辛基[66]。1.3.2.3密度胍盐离子液体的密度大小与阴离子的体积、配位能力、阳离子的结构和取代
胍盐离子液体修饰的磁性纳米材料纯化生物样品中的DNA25箱中。取200μL等份的人全血样品与20μL蛋白酶k（20ugμL-1）混合，旋涡震荡10秒，然后加入200μL缓冲液gA1，充分混合，混合物放入70℃水浴孵育15分钟后，加入200μL无水乙醇轻柔混匀。将裂解液转入中装有GIL-MCGO的离心管中萃取10分钟，用500μLBufferPW缓冲液预洗涤两次，再用80％的乙醇洗涤一次后，取500μLpH=10的BR缓冲液（0.04mmolL-1）洗脱DNA，得到质粒DNA溶液，用1.2％琼脂糖电泳测试DNA的纯度后，用于PCR扩增。图2-2磁性复合纳米材料从复杂生物样品基质中提取DNA流程图PCR程序：使用543bp的P53基因片段（引物序列见表2-3）进行PCR。PCR混合物由2μL回收的DNA，2μL正向/反向引物（10umolL-1），25μL2×TaqPlusMasterMix组成，最终体积为50μL。PCR温度程序为95℃下反应3分钟，从90℃反应15秒、57℃反应20秒至72℃反应1分钟循环30次，最终在72℃延伸10分钟。GIL-MCGO萃取DNA的流程图如图2-2所示：
【参考文献】：
期刊论文
[1]磁珠法快速提取基因组DNA的实验研究[J]. 许朋,郑春辉,孙智勇,余兰,冯昆. 生物信息学. 2018(03)
[2]Fe3O4/SDS磁性纳米颗粒吸附水体中的Cd2+和Zn2+[J]. 黄文,周梅芳. 环境工程学报. 2012(04)
[3]磁性壳聚糖微球的研究进展[J]. 宋艳艳,孔维宝,宋昊,华绍烽,夏春谷. 化工进展. 2012(02)
[4]Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰研究进展[J]. 熊雷,姜宏伟,王迪珍. 材料导报. 2008(05)
[5]胍盐离子液体的研究进展[J]. 段海峰,郭旭,李胜海,林英杰,张所波,谢海波. 有机化学. 2006(10)
[6]DNA提取方法的研究进展[J]. 裴杰萍,端青. 微生物学免疫学进展. 2004(03)
[7]新型室温离子液体六烷基胍盐的制备及性质[J]. 段海峰,张所波,林英杰,邱志明,王宗睦. 高等学校化学学报. 2003(11)
[8]从土壤中分离DNA的研究进展[J]. 杨瑞馥. 微生物学免疫学进展. 2000(02)
硕士论文
[1]高响应性磁性微球的制备及其生物分离应用[D]. 曹菁菁.天津大学 2009
本文编号：2925436
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
磁性固相萃取流程图
硕士学位论文10图1-2胍盐离子液体的化学结构1.3.2胍盐离子液体的性质1.3.2.1热稳定性和化学稳定性由于胍盐阳离子含有三个氮原子能与其中心的碳原子共轭，因此具有高热稳定性和化学稳定性。而胍盐离子液体的热失重温度与其阴、阳离子的组成相关，除了少数酸性和硝酸盐胍盐离子液体热失重的温度较低，其他胍盐离子液体的热分解温度大约在200-353℃之间[66]。通过利用胍盐的热稳定性和化学稳定性，胍盐离子液体已经被用作高温条件下的一种催化剂[62]。1.3.2.2熔点低熔点的离子液体具有：阳离子低对称性、弱分子间作用力、离子电荷分布均匀[67,68]。胍盐离子液体所含阴、阳离子的种类和结构影响着其熔点的高低。由于胍盐阳离子具有三个氮原子能与中心碳原子形成共轭，正电荷分布在中心碳原子和三个氮原子上，使得不对称烷基取代的胍盐具有较低的熔点。有研究发现，对于胍盐离子液体的Tm/Tg值而言：环状化合物＞链状化合物，含氧化合物＞不含氧化合物；链状胍盐的熔点随着烷基的大小而降低，如：正己基＞正丁基＞正辛基[66]。1.3.2.3密度胍盐离子液体的密度大小与阴离子的体积、配位能力、阳离子的结构和取代
胍盐离子液体修饰的磁性纳米材料纯化生物样品中的DNA25箱中。取200μL等份的人全血样品与20μL蛋白酶k（20ugμL-1）混合，旋涡震荡10秒，然后加入200μL缓冲液gA1，充分混合，混合物放入70℃水浴孵育15分钟后，加入200μL无水乙醇轻柔混匀。将裂解液转入中装有GIL-MCGO的离心管中萃取10分钟，用500μLBufferPW缓冲液预洗涤两次，再用80％的乙醇洗涤一次后，取500μLpH=10的BR缓冲液（0.04mmolL-1）洗脱DNA，得到质粒DNA溶液，用1.2％琼脂糖电泳测试DNA的纯度后，用于PCR扩增。图2-2磁性复合纳米材料从复杂生物样品基质中提取DNA流程图PCR程序：使用543bp的P53基因片段（引物序列见表2-3）进行PCR。PCR混合物由2μL回收的DNA，2μL正向/反向引物（10umolL-1），25μL2×TaqPlusMasterMix组成，最终体积为50μL。PCR温度程序为95℃下反应3分钟，从90℃反应15秒、57℃反应20秒至72℃反应1分钟循环30次，最终在72℃延伸10分钟。GIL-MCGO萃取DNA的流程图如图2-2所示：
【参考文献】：
期刊论文
[1]磁珠法快速提取基因组DNA的实验研究[J]. 许朋,郑春辉,孙智勇,余兰,冯昆. 生物信息学. 2018(03)
[2]Fe3O4/SDS磁性纳米颗粒吸附水体中的Cd2+和Zn2+[J]. 黄文,周梅芳. 环境工程学报. 2012(04)
[3]磁性壳聚糖微球的研究进展[J]. 宋艳艳,孔维宝,宋昊,华绍烽,夏春谷. 化工进展. 2012(02)
[4]Fe3O4磁性纳米粒子表面修饰研究进展[J]. 熊雷,姜宏伟,王迪珍. 材料导报. 2008(05)
[5]胍盐离子液体的研究进展[J]. 段海峰,郭旭,李胜海,林英杰,张所波,谢海波. 有机化学. 2006(10)
[6]DNA提取方法的研究进展[J]. 裴杰萍,端青. 微生物学免疫学进展. 2004(03)
[7]新型室温离子液体六烷基胍盐的制备及性质[J]. 段海峰,张所波,林英杰,邱志明,王宗睦. 高等学校化学学报. 2003(11)
[8]从土壤中分离DNA的研究进展[J]. 杨瑞馥. 微生物学免疫学进展. 2000(02)
硕士论文
[1]高响应性磁性微球的制备及其生物分离应用[D]. 曹菁菁.天津大学 2009
本文编号：2925436
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