CRISPR/Cas9介导绿色荧光蛋白基因在牛KRT18位点定点整合的研究

发布时间：2021-01-20 16:34

　　角蛋白是一种外胚层结构蛋白,是硬蛋白家族成员之一。据报道,角蛋白对生殖过程特别是对早期胚胎发育起着至关重要的作用,被作为滋养层上皮细胞的标记物。目前有关角蛋白的研究甚少,已知的角蛋白主要在表皮细胞以及简单上皮细胞中表达,具有高度的上皮细胞类型和组织分化的特异性。其中细胞角蛋白18（KRT18）属于Ⅰ型（等电点为4.9-5.4）酸性角蛋白,不仅在稳定细胞结构、形态以及细胞的完整性与功能性方面有着重要的作用,而且在细胞周期、胞内信号通路、细胞凋亡、有丝分裂、早期胚胎着床等细胞内生理过程中也发挥着重要的作用。本研究针对牛角蛋白18（KRT18）基因设计并构建了 CRISPR/Cas9表达载体,称为Cas9/gRNA。实验选用的质粒载体具有新霉素抗性基因（Neor）,通过对基础框架载体进行去除CAG启动子的改造（命名为pGlrkt-2）和KRT18基因5’及3’同源臂的插入,构建了针对CRISPR/Cas9切割位点的同源打靶载体,并命名为pKlrkt.其外源基因为人源化的EGFP,在EGFP上游包含长995bp的5’同源臂,在pKlrkt表达框架下游包含长946bp的3’同源臂。经限制性酶切片... 

【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一部分 实验研究
    第一章 pKlrkt打靶载体的构建
        前言
        1 试剂和设备
            1.1 实验试剂和材料
            1.2 仪器和设备
        2 方法
            2.1 牛胎儿成纤维细胞基因组DNA的提取
            2.2 角蛋白18 （KRT18）基因同源臂的获取
            2.3 同源臂的PCR扩增鉴定和一代基因测序比对分析
            2.4 基础载体pGlrkt-1去除CAG启动子改造
            2.5 3'同源臂连入基础载体
            2.6 5'同源臂连入基础载体
            2.7 pKlrkt基础载体的脂质体转染鉴定
        3 结果
            3.1 基础载体pGlrkt-1去除启动子的结果
            3.2 同源臂扩增结果
            3.3 质粒构建结果
            3.4 pKlrkt载体鉴定结果
        4 讨论
        参考文献
    第二章 CRISPR/Cas9介导GFP基因在牛KRT18位点的定点整合
        前言
        1 试剂和设备
            1.1 实验试剂和材料
            1.2 仪器设备
        2 方法
            2.1 CRISPR/Cas9载体的构建
            2.2 打靶细胞的制备和筛选
            2.3 基因组的提取
                2.3.1 细胞裂解液的配制[21]:
                2.3.2 基因组的提取
            2.4 转基因细胞的鉴定
        3 结果
            3.1 电转染条件的优化
            3.2 同源臂RT-PCR鉴定结果
        4 讨论
        5 结论
        参考文献
    实验总结
第二部分 文献综述 KRT18蛋白研究进展
    前言
    1 角蛋白18 （KRT18）的功能特点
    2 角蛋白18（KRT18）的调节机理
        2.1 角蛋白18 （KRT18）发挥调节机理的功能
        2.2 早期胚胎中牛和小鼠KRT18的表达
    3 KRT18对胚胎分化作用的影响
        3.1 KRT18随着小鼠妊娠期的变化而变化
        3.2 KRT18对牛囊胚和囊胚发育的作用
    4 细胞角蛋白18（KRT18）与疾病
        4.1 细胞角蛋白18（KRT18）与癌症
            4.1.1 细胞角蛋白18 （KRT18）与肝癌
            4.1.2 细胞角蛋白18 （KRT18）与乳腺癌
            4.1.3 细胞角蛋白18 （KRT18）与胃癌
            4.1.4 细胞角蛋白18 （KRT18）与预后标记物
        4.2 细胞角蛋白18 （KRT18）与白血病相关蛋白
    5 相关研究技术
    6 存在的问题
    参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]CRISPR/Cas系统最新研究进展[J]. 刘妮,陆沁,刘娟,陈航.  生物技术通报. 2017(02)
[2]动物基因组定点整合转基因技术研究进展[J]. 李国玲,钟翠丽,莫健新,全绒,吴珍芳,李紫聪,杨化强,张献伟.  遗传. 2017(02)
[3]食管鳞癌中角蛋白14及胃泌素基因启动子区甲基化及蛋白表达特征研究[J]. 徐紫光,周胜理,孙廷谊,李真,孔令非.  中国优生与遗传杂志. 2017(01)
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[6]角蛋白18、CEA、CA19-9、CA72-4在胃癌诊断中的成本-效果分析[J]. 王连文,崔艳芳,刘敬波,白玉,李娜,袁笑,李金玲.  滨州医学院学报. 2016(05)
[7]细胞角蛋白18与临床相关疾病的研究[J]. 尹岩.  武警后勤学院学报(医学版). 2016(08)
[8]三阴乳腺癌的研究及治疗进展[J]. 高志艳,李文新.  内蒙古医科大学学报. 2016(03)
[9]大鳞副泥鳅角蛋白18基因cDNA的全长克隆与序列分析[J]. 刘士力,吴卫君,张爱菊,练青平,王雨辰,辛建美,胡廷尖,贾永义.  江西农业大学学报. 2016(02)
[10]生物技术应用于角蛋白降解的潜力 以微生物及其酶改善羽毛与其它角蛋白的营养价值作为家禽饲料的资源[J]. A.A.Onifade,N.A.Al-Sane,A.A.Al-Musallam,S.Al-Zarban,张本民.  西部皮革. 2016(07)

博士论文
[1]猪滋养层细胞的培养鉴定及ROCK抑制剂Y-27632对其影响的研究[D]. 侯东霞.内蒙古大学 2015
[2]ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究[D]. 赵宇航.内蒙古大学 2014

硕士论文
[1]RNA模板介导同源重组修复的探讨及不同CRISPR/Cas9系统的比较研究[D]. 韩芙蓉.西北农林科技大学 2016



本文编号：2989389