PEDV变异株的分子流行病学调查及三种毒株双重RT-PCR鉴别检测方法的建立
发布时间：2021-02-02 09:09
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是当前临床上导致仔猪腹泻最常见的致病性病原之一,自1971年该病被发现起,时至今日仍持续危害着整个养猪业,给我国造成了严重的经济损失。本研究为了掌握目前山东多个地区PEDV流行毒株S基因的遗传变异情况,并对PEDV疫苗株、变异株与经典株建立鉴别诊断方法,利用建立的鉴别诊断方法对临床上大批量样品进行检测鉴定。试验采用Trizol法提取病毒总RNA,针对PEDV S基因设计4对特异性引物,RT-PCR方法分段扩增S基因全序列,将本研究所获得的PEDV毒株序列与其他地区分离得到的流行株基因序列对比、分析,构建PEDV S基因遗传进化树;针对ORF3基因缺失部位与S基因的变异区域设计两对特异性引物利用双重RT-PCR技术建立鉴别诊断PEDV三种毒株的方法。试验结果显示,PEDV疑似病料的总阳性率为76.40%,同源性分析本研究获得的8株PEDV变异株,此8株变异株的S基因序列多处存在插入、缺失与变异现象,且各毒株的基因序列之间存在较大的差异,从遗传进化树上可观察到此8株变异株分别位于三个大分支上;本研究...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV基因组结构示意图；(b)PEDV结构示意图（Songetal.,2012）
不同毒株与两种引物所扩增的基因片段的大小差异，对三者进行鉴别。表4PEDV变异株、经典株、疫苗株鉴别引物序列及大小Table4SequenceandsizeofprimersforidentifyingPEDVvariants,classicalstrainsandvaccinestrains名称name引物序列Primersequence条带大小Stripsize扩增毒株Amplifiedstrain扩增基因AmplifiedgeneGF：GTTGGCAGCGCGTTTTGCTGTCR：GCTGCTTTACCATTGAGAAAAG198bp变异株、经典株ORF3149bp疫苗株CF：ACAAGATGTCACTAGGTGCCAGR：ATGCCGACAACAATATCTTTTC429bp经典株疫苗株S图2G、C两种引物分别在ORF3基因与S基因上的扩增示意图（图片来源：引自www.ncbi.nlm.nih.gov）Fig.2SchematicdiagramoftheamplificationofGandCprimersontheORF3geneandSgenerespectively(photosource:www.ncbi.nlm.nih.gov)a：G引物在疫苗株上的扩增示意图；b：G引物在经典株/变异株上的扩增示意图；c：C引物在经典株/疫苗株上的扩增示意图；a:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonvaccinestrains;b:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/mutantstrains;c:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/vaccinestrains;
PEDV变异株的分子流行病学调查及三种毒株双重RT-PCR鉴别检测方法的建立223结果与分析3.1PEDV阳性检测结果与分析以Trizol法提取出的猪粪便RNA经逆转录得到cDNA，以得到的cDNA作为PCR模板，应用P引物进行基因扩增，对全部样品进行阳性检测。根据预期设计，其扩增产物大小为273bp，经电泳结果观察对比，实际结果与预期一致（图3）。本试验样品分别采集于山东省的9个地区多个PEDV疑似发病猪场，样品采集总数为1212份，共检出PEDV阳性样品为926份，总阳性检出率为76.40%（表5）。带毒猪与发病猪可通过粪便向外界排毒，继而在猪群内造成持续感染的现象，因此在有发病猪与带毒猪的猪群内PEDV的阳性检出率极高。图3猪流行性腹泻病毒阳性检测结果Fig.3PositiveresultsofporcineepidemicdiarrheavirusM：DNA分子量标准（DL2501）；1-2：猪流行性腹泻病毒病料M:DNAMarker(DL2501);1-2:PorcineEpidemicDiarrheaVirus表5PEDV样品阳性率统计Table5PEDVsamplepositiveratestatistics采样地区Samplingarea采集时间Acquisitiontime采集样品数Numberofsamplescollected阳性样品数Numberofpositivesamples阳性率（%）Positiverate(%)济南2019.51289876.56
【参考文献】：
期刊论文
[1]Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus（PEDV） HLJ Strain with IPEC-J2 Cells and Phylogenetic Analysis of Its S Gene[J]. Feng Rui,Liu Hai-xin,Zhong Ming,Li Xun-liang,Huang Xiao-dan,Ren Yu-dong,Li Guang-xing. Journal of Northeast Agricultural University（English Edition）. 2019(04)
[2]2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析[J]. 王睿敏,施开创,严瑾,谢守玉,黎宗强,尹彦文,陆文俊,屈素洁. 中国兽医科学. 2020(02)
[3]2016-2018年吉林地区猪流行性腹泻仔猪小肠组织灭活液免疫效果研究[J]. 沙万里,闫满,丛薇,刘东旭,尹柏双,李国江. 中国兽药杂志. 2019(11)
[4]猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立[J]. 王永恒,周孟云,李昱辰,刘朋,杨倩. 中国兽医科学. 2020(01)
[5]基于猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 杨朋霞,闫若潜,王华俊,马震原,王淑娟,赵雪丽,谢彩华,赵月龙,李孟. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[6]表达PEDV S和PoRV VP7蛋白的重组伪狂犬毒株构建[J]. 毛汐语,周雪珂,殷鑫欢,邓益超,龚双燕,李小璟,李幽幽,徐志文,朱玲. 微生物学通报. 2019(12)
[7]猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析检测方法的建立[J]. 贾宇旻,徐飞,边洪芬,王娟,贾爱卿,唐勇,贾杏林. 中国预防兽医学报. 2019(09)
[8]10株猪流行性腹泻病毒序列分析[J]. 杨小蓉,马良,许磊,赵晨璐,周建民. 中国兽医杂志. 2019(07)
[9]猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响[J]. 唐融志,陈智,焦安琪,赵鲁,于江,张玉玉,孙文博,张树金,曾昊,彭军,吴家强. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[10]PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 马宇聪,刘增素,王书博,周晗,姜艳萍,崔文,王丽,乔薪瑗,唐丽杰,徐义刚,李一经. 中国兽医科学. 2019(09)
本文编号：3014451
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
PEDV基因组结构示意图；(b)PEDV结构示意图（Songetal.,2012）
不同毒株与两种引物所扩增的基因片段的大小差异，对三者进行鉴别。表4PEDV变异株、经典株、疫苗株鉴别引物序列及大小Table4SequenceandsizeofprimersforidentifyingPEDVvariants,classicalstrainsandvaccinestrains名称name引物序列Primersequence条带大小Stripsize扩增毒株Amplifiedstrain扩增基因AmplifiedgeneGF：GTTGGCAGCGCGTTTTGCTGTCR：GCTGCTTTACCATTGAGAAAAG198bp变异株、经典株ORF3149bp疫苗株CF：ACAAGATGTCACTAGGTGCCAGR：ATGCCGACAACAATATCTTTTC429bp经典株疫苗株S图2G、C两种引物分别在ORF3基因与S基因上的扩增示意图（图片来源：引自www.ncbi.nlm.nih.gov）Fig.2SchematicdiagramoftheamplificationofGandCprimersontheORF3geneandSgenerespectively(photosource:www.ncbi.nlm.nih.gov)a：G引物在疫苗株上的扩增示意图；b：G引物在经典株/变异株上的扩增示意图；c：C引物在经典株/疫苗株上的扩增示意图；a:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonvaccinestrains;b:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/mutantstrains;c:SchematicdiagramofamplificationofGprimersonclassicstrains/vaccinestrains;
PEDV变异株的分子流行病学调查及三种毒株双重RT-PCR鉴别检测方法的建立223结果与分析3.1PEDV阳性检测结果与分析以Trizol法提取出的猪粪便RNA经逆转录得到cDNA，以得到的cDNA作为PCR模板，应用P引物进行基因扩增，对全部样品进行阳性检测。根据预期设计，其扩增产物大小为273bp，经电泳结果观察对比，实际结果与预期一致（图3）。本试验样品分别采集于山东省的9个地区多个PEDV疑似发病猪场，样品采集总数为1212份，共检出PEDV阳性样品为926份，总阳性检出率为76.40%（表5）。带毒猪与发病猪可通过粪便向外界排毒，继而在猪群内造成持续感染的现象，因此在有发病猪与带毒猪的猪群内PEDV的阳性检出率极高。图3猪流行性腹泻病毒阳性检测结果Fig.3PositiveresultsofporcineepidemicdiarrheavirusM：DNA分子量标准（DL2501）；1-2：猪流行性腹泻病毒病料M:DNAMarker(DL2501);1-2:PorcineEpidemicDiarrheaVirus表5PEDV样品阳性率统计Table5PEDVsamplepositiveratestatistics采样地区Samplingarea采集时间Acquisitiontime采集样品数Numberofsamplescollected阳性样品数Numberofpositivesamples阳性率（%）Positiverate(%)济南2019.51289876.56
【参考文献】：
期刊论文
[1]Isolation and Identification of Porcine Epidemic Diarrhea Virus（PEDV） HLJ Strain with IPEC-J2 Cells and Phylogenetic Analysis of Its S Gene[J]. Feng Rui,Liu Hai-xin,Zhong Ming,Li Xun-liang,Huang Xiao-dan,Ren Yu-dong,Li Guang-xing. Journal of Northeast Agricultural University（English Edition）. 2019(04)
[2]2017—2019年猪流行性腹泻病毒广西流行毒株遗传多样性分析[J]. 王睿敏,施开创,严瑾,谢守玉,黎宗强,尹彦文,陆文俊,屈素洁. 中国兽医科学. 2020(02)
[3]2016-2018年吉林地区猪流行性腹泻仔猪小肠组织灭活液免疫效果研究[J]. 沙万里,闫满,丛薇,刘东旭,尹柏双,李国江. 中国兽药杂志. 2019(11)
[4]猪流行性腹泻病毒黏液SIgA抗体ELISA检测方法的建立[J]. 王永恒,周孟云,李昱辰,刘朋,杨倩. 中国兽医科学. 2020(01)
[5]基于猪流行性腹泻病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用[J]. 杨朋霞,闫若潜,王华俊,马震原,王淑娟,赵雪丽,谢彩华,赵月龙,李孟. 中国预防兽医学报. 2019(10)
[6]表达PEDV S和PoRV VP7蛋白的重组伪狂犬毒株构建[J]. 毛汐语,周雪珂,殷鑫欢,邓益超,龚双燕,李小璟,李幽幽,徐志文,朱玲. 微生物学通报. 2019(12)
[7]猪流行性腹泻病毒单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析检测方法的建立[J]. 贾宇旻,徐飞,边洪芬,王娟,贾爱卿,唐勇,贾杏林. 中国预防兽医学报. 2019(09)
[8]10株猪流行性腹泻病毒序列分析[J]. 杨小蓉,马良,许磊,赵晨璐,周建民. 中国兽医杂志. 2019(07)
[9]猪流行性腹泻病毒JX16株的分离鉴定及体外传代对其毒力的影响[J]. 唐融志,陈智,焦安琪,赵鲁,于江,张玉玉,孙文博,张树金,曾昊,彭军,吴家强. 中国畜牧兽医. 2019(06)
[10]PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立[J]. 马宇聪,刘增素,王书博,周晗,姜艳萍,崔文,王丽,乔薪瑗,唐丽杰,徐义刚,李一经. 中国兽医科学. 2019(09)
本文编号：3014451
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