C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及其免疫效果评价
发布时间：2021-02-09 20:57
梭菌病是由梭菌属（Clostridium）中致病性菌种引起的疾病的总称。通常包括产气荚膜梭菌、腐败梭菌、破伤风梭菌等。其中对于我国威胁最大的便是产气荚膜梭菌和腐败梭菌。梭菌病发病急促,病程短,死亡率高。动物一旦发病往往来不及治疗便发生死亡。因而免疫接种是预防本病的最为直接有效的方法。目前国内的三联四防疫苗其主要抗原成分多为菌体或类毒素,而腐败梭菌作为一种严格厌氧菌,本身的培养难度大,产毒能力弱,使得疫苗的防护能力大打折扣。通过基因工程表达的重组腐败梭菌α毒素可以保留天然毒素的免疫原性,同时生产工艺简单,可以用于三联四防疫苗的升级换代。因此,本研究拟制备C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗。在本研究中,对C型产气荚膜梭菌（NCTC 3180）和D型产气荚膜梭菌（NCTC 8346）进行复苏、增菌和产毒。利用一次性细菌滤器过滤除菌获得毒素溶液。并利用本实验室构建完成的表达重组腐败梭菌α毒素的质粒通过原核表达系统生产重组蛋白。将C、D型产气荚膜梭菌天然毒素和重组腐败梭菌α毒素按一定比例混合后经过甲醛灭活后,加入白油佐剂制得二联二价疫苗。对制备的疫苗进行物理性状检查、无菌...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细菌革兰氏染色镜检图（A：C型产气荚膜梭菌染色菌染色镜检图）
山东农业大学硕士学位论文253.结果3.1毒素的制备3.1.1C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的复苏将C型产气荚膜梭菌（NCTC3180）、D型产气荚膜梭菌（NCTC8346）和腐败梭菌（ATCC12464）等菌种进行复苏后，将其接种在增菌培养基，并进行革兰氏染色发现。图1A和图1B中菌体呈现典型的革兰氏阳性杆菌，两端钝圆，边缘笔直，部分菌体成对出现。符合产气荚膜梭菌的形态。而在图1C中，细菌呈革兰氏阳性，菌体为丝状聚集在一起，具有明显的腐败梭菌形态特征。上述结果初步证明细菌增殖成功。3.1.2C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的PCR鉴定复苏成功且大量增菌的C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌通过煮沸使菌体破裂提取细菌的DNA，并用相应的鉴定引物进行PCR扩增和凝胶电泳的鉴定分析。结果如图2所示，成功克隆出C型产气荚膜梭菌特异性基因（85bp），D型产气荚膜梭菌特异性基因（697bp），在图3中成功克隆腐败梭菌特异性基因（208bp），测序结果正确。图1细菌革兰氏染色镜检图（A：C型产气荚膜梭菌染色镜检图；B：D型产气荚膜梭菌染色镜检图；C：腐败梭菌染色镜检图）Fig.1microscopicexaminationofGramstainingofbacteria(A:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeC;B:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeD;C:microscopicexaminationofClostridiumsepticum)ABC
C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及免疫效果的评价26bpM1234567891011123.1.3表达重组腐败梭菌α毒素阳性克隆菌株的筛选重组质粒转化完成后，随机在LB培养基上挑取单个菌落（图4），经过增菌培养后，选取数株增菌效果良好的菌株进行PCR鉴定和测序分析，用于阳性菌株的筛眩PCR鉴定结果如图5所示，在1500bp左右可见明显条带，符合预期。送检测序结果正确。说明所选取的菌株均为阳性克隆菌株，可用于重组腐败梭菌α毒素蛋白的表达。bpM1234567图2细菌PCR鉴定电泳图（M：Maker；1-5：C型产气荚膜梭菌特异性基因片段；6：阴性对照；7-11：D型产气荚膜梭菌特异性基因片段；12：阴性对照）Figure2ElectrophoresisimagesofbacterialPCRidentification(M:Maker;1-5:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;6:negativecontrol;7-11:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;12:negativecontrol)图3腐败梭菌鉴定电泳图（M：Maker；1：腐败梭菌特异性基因片段；2：阴性对照）Figure3ElectrophoresisofClostridiumsepticumidentification(M:Maker;1:Clostridiumsepticum-specificgenefragment;2:Negativecontrol)图4：转化的大肠杆菌在LB培养基上生长Figure4:TransformedE.coligrowsonLBmedium50003000200010007505002501001500bp图5阳性克隆株PCR扩增产物电泳图（M：Maker；1-6：待检菌液；7：阴性对照）Figure5ElectrophoresismapofPCRamplificationproductsofpositiveclones(M:Maker;1-6:bacterialsolutiontobetested;7:negativecontrol)20001000750500250100bpM1220001000750500250100
【参考文献】：
期刊论文
[1]新西兰兔产气荚膜梭菌性腹泻引起的脏器损伤和肠道菌群分析[J]. 陈端端,刘伟,孟德志,许文萍,杨玲玲,柴同杰,王海荣. 中国兽医学报. 2019(12)
[2]产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价[J]. 杜吉革,薛麒,朱真,李启红,印春生,姚文生,康凯,陈小云. 中国兽医学报. 2019(02)
[3]产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性双重荧光定量PCR方法的建立及应用[J]. 张蓉蓉,张腾飞,艾地云,罗青平,温国元,王红琳,邵华斌. 黑龙江畜牧兽医. 2017(01)
[4]绵羊腐败梭菌病的病原诊断[J]. 尹相虎,李生庆,李志宁,范玉霞. 中国兽医杂志. 2015(09)
[5]产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J]. 孙佳芝,王新桐,刘雪慧,苗增民,刘志浩,王海荣,柴同杰. 中国兽医学报. 2014(06)
[6]青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性研究[J]. 吕长辉,王方山,孙佳芝,郝海玉,刘雪慧,李超,王海荣. 中国预防兽医学报. 2014(02)
[7]产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定[J]. 王超,唐丽杰,葛俊伟,乔薪媛,崔文,姜艳萍,李一经. 中国预防兽医学报. 2013(06)
[8]梅花鹿腐败梭菌病的诊断[J]. 李生庆,张西云,范玉霞,李秀萍,胡国元,刘生财,王亭亭. 畜牧与兽医. 2011(05)
[9]A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺[J]. 吕静,柴同杰,张兴晓,王炳晓. 中国兽医学报. 2010(01)
[10]一起獭兔产气荚膜梭菌病的诊治[J]. 杨玉芝. 中国养兔杂志. 2008(08)
硕士论文
[1]腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立[D]. 林静.山东农业大学 2019
[2]E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的研制[D]. 马连营.山东农业大学 2018
[3]鸭坦布苏病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌三联苗的研制[D]. 刘晓文.华南农业大学 2016
[4]产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立及初步应用[D]. 秦贵平.山东农业大学 2016
[5]A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的临床应用和保护效果评价[D]. 林晓佳.山东农业大学 2016
[6]C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的制备研究[D]. 樊金.山东农业大学 2015
本文编号：3026223
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：62 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
细菌革兰氏染色镜检图（A：C型产气荚膜梭菌染色菌染色镜检图）
山东农业大学硕士学位论文253.结果3.1毒素的制备3.1.1C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的复苏将C型产气荚膜梭菌（NCTC3180）、D型产气荚膜梭菌（NCTC8346）和腐败梭菌（ATCC12464）等菌种进行复苏后，将其接种在增菌培养基，并进行革兰氏染色发现。图1A和图1B中菌体呈现典型的革兰氏阳性杆菌，两端钝圆，边缘笔直，部分菌体成对出现。符合产气荚膜梭菌的形态。而在图1C中，细菌呈革兰氏阳性，菌体为丝状聚集在一起，具有明显的腐败梭菌形态特征。上述结果初步证明细菌增殖成功。3.1.2C、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌的PCR鉴定复苏成功且大量增菌的C型产气荚膜梭菌、D型产气荚膜梭菌和腐败梭菌通过煮沸使菌体破裂提取细菌的DNA，并用相应的鉴定引物进行PCR扩增和凝胶电泳的鉴定分析。结果如图2所示，成功克隆出C型产气荚膜梭菌特异性基因（85bp），D型产气荚膜梭菌特异性基因（697bp），在图3中成功克隆腐败梭菌特异性基因（208bp），测序结果正确。图1细菌革兰氏染色镜检图（A：C型产气荚膜梭菌染色镜检图；B：D型产气荚膜梭菌染色镜检图；C：腐败梭菌染色镜检图）Fig.1microscopicexaminationofGramstainingofbacteria(A:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeC;B:microscopicexaminationofClostridiumperfringenstypeD;C:microscopicexaminationofClostridiumsepticum)ABC
C、D型产气荚膜梭菌类毒素和重组腐败梭菌α毒素二价二联疫苗的制备及免疫效果的评价26bpM1234567891011123.1.3表达重组腐败梭菌α毒素阳性克隆菌株的筛选重组质粒转化完成后，随机在LB培养基上挑取单个菌落（图4），经过增菌培养后，选取数株增菌效果良好的菌株进行PCR鉴定和测序分析，用于阳性菌株的筛眩PCR鉴定结果如图5所示，在1500bp左右可见明显条带，符合预期。送检测序结果正确。说明所选取的菌株均为阳性克隆菌株，可用于重组腐败梭菌α毒素蛋白的表达。bpM1234567图2细菌PCR鉴定电泳图（M：Maker；1-5：C型产气荚膜梭菌特异性基因片段；6：阴性对照；7-11：D型产气荚膜梭菌特异性基因片段；12：阴性对照）Figure2ElectrophoresisimagesofbacterialPCRidentification(M:Maker;1-5:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;6:negativecontrol;7-11:Clostridiumperfringens-specificgenefragments;12:negativecontrol)图3腐败梭菌鉴定电泳图（M：Maker；1：腐败梭菌特异性基因片段；2：阴性对照）Figure3ElectrophoresisofClostridiumsepticumidentification(M:Maker;1:Clostridiumsepticum-specificgenefragment;2:Negativecontrol)图4：转化的大肠杆菌在LB培养基上生长Figure4:TransformedE.coligrowsonLBmedium50003000200010007505002501001500bp图5阳性克隆株PCR扩增产物电泳图（M：Maker；1-6：待检菌液；7：阴性对照）Figure5ElectrophoresismapofPCRamplificationproductsofpositiveclones(M:Maker;1-6:bacterialsolutiontobetested;7:negativecontrol)20001000750500250100bpM1220001000750500250100
【参考文献】：
期刊论文
[1]新西兰兔产气荚膜梭菌性腹泻引起的脏器损伤和肠道菌群分析[J]. 陈端端,刘伟,孟德志,许文萍,杨玲玲,柴同杰,王海荣. 中国兽医学报. 2019(12)
[2]产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达及免疫保护力评价[J]. 杜吉革,薛麒,朱真,李启红,印春生,姚文生,康凯,陈小云. 中国兽医学报. 2019(02)
[3]产气荚膜梭菌肠毒素cpe阳性双重荧光定量PCR方法的建立及应用[J]. 张蓉蓉,张腾飞,艾地云,罗青平,温国元,王红琳,邵华斌. 黑龙江畜牧兽医. 2017(01)
[4]绵羊腐败梭菌病的病原诊断[J]. 尹相虎,李生庆,李志宁,范玉霞. 中国兽医杂志. 2015(09)
[5]产气荚膜梭菌α毒素双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用[J]. 孙佳芝,王新桐,刘雪慧,苗增民,刘志浩,王海荣,柴同杰. 中国兽医学报. 2014(06)
[6]青岛地区规模化兔场产气荚膜梭菌流行株毒素型、遗传多样性和耐药性研究[J]. 吕长辉,王方山,孙佳芝,郝海玉,刘雪慧,李超,王海荣. 中国预防兽医学报. 2014(02)
[7]产气荚膜梭菌ε毒素突变基因的表达及其抗体中和效价测定[J]. 王超,唐丽杰,葛俊伟,乔薪媛,崔文,姜艳萍,李一经. 中国预防兽医学报. 2013(06)
[8]梅花鹿腐败梭菌病的诊断[J]. 李生庆,张西云,范玉霞,李秀萍,胡国元,刘生财,王亭亭. 畜牧与兽医. 2011(05)
[9]A型产气荚膜梭菌α-毒素生产发酵工艺[J]. 吕静,柴同杰,张兴晓,王炳晓. 中国兽医学报. 2010(01)
[10]一起獭兔产气荚膜梭菌病的诊治[J]. 杨玉芝. 中国养兔杂志. 2008(08)
硕士论文
[1]腐败梭菌α毒素单抗、多抗的制备及DAS-ELISA方法的初步建立[D]. 林静.山东农业大学 2019
[2]E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的研制[D]. 马连营.山东农业大学 2018
[3]鸭坦布苏病毒、鸭源大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌三联苗的研制[D]. 刘晓文.华南农业大学 2016
[4]产气荚膜梭菌α毒素免疫组化检测方法的建立及初步应用[D]. 秦贵平.山东农业大学 2016
[5]A型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的临床应用和保护效果评价[D]. 林晓佳.山东农业大学 2016
[6]C型产气荚膜梭菌类毒素疫苗与抗毒素血清的制备研究[D]. 樊金.山东农业大学 2015
本文编号：3026223
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