PEAR技术制备修饰性寡核苷酸及大肠杆菌移码突变恢复相关研究

发布时间：2017-04-14 00:05

  本文关键词：PEAR技术制备修饰性寡核苷酸及大肠杆菌移码突变恢复相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：人工合成的寡核苷酸在基因调控方面有重要而广泛的用途。一些寡核苷酸,例如反义寡核苷酸、CpG寡核苷酸和核酸适配体等已经成功应用于基因治疗上。但是,大量制备寡核苷酸不仅困难而且花费特别高。这不仅需要昂贵的合成仪器而且需要繁琐的纯化程序,因为化学合成的寡核苷酸含有大量的错误序列。之前,本实验室报道了一种“聚合酶-内切酶扩增反应”,可以用来制备非修饰性和硫代修饰性寡核苷酸。本文将这种技术延伸用于制备氟代修饰以及氟硫混合修饰寡核苷酸。实验结果显示,KOD DNA聚合酶和Phusion DNA聚合酶都可以用来扩增含有一种或两种修饰碱基的寡核苷酸,但是KOD DNA聚合酶在扩增氟代和氟硫双代寡核苷酸时更具优势。之后用质谱检测了PEAR产物成分,证明PEAR扩增具有极高的准确性。PEAR产物经完全酶切,所有缩短了的产物量非常低(4.8%),全长产物比例达到95.2%,全长修饰性产物比例达到89.2%。PEAR反应能有效地合成修饰性寡核苷酸。并且拥有诸多优点,例如：成本低、无污染、产物纯度高、纯化简单、容易扩大规模。我们相信,这种技术是一种有用的酶促合成寡核苷酸方法。另外,同源重组不仅在生物进化中起重要的作用,而且成为定向改造基因的技术。据报道,微生物可以吸收外界单链DNA,并且在体内将外界DNA插入到基因组同源区域内,从而造成基因组的定点突变。我们将双链DNA及经过化学修饰的双链DNA导入细菌体内时,预期遗传重组的效率可能会有所提高。为此,我们选取质粒pBR322为研究对象,设计了其β-内酰胺酶基因移码突变体。在外源单链野生型寡核苷酸的作用下,移码突变位点可以被定向修复,检测到少量恢复突变体。然而,双链寡核苷酸非但没有提高修复效率,反而没有检测到恢复突变体。同时发现,在没有寡核苷酸介导的情况下,移码突变也可以自发恢复。对回复突变菌株进行传代培养,观察到其存活率和生长速率随着代数增加而逐渐增长的现象,移码突变后读码框恢复不是快速的而是渐进式的。对自发恢复的菌株进行了测序分析,结果显示,在抗生素的筛选作用下,在移码突变位点前后不同位置插入随机的碱基,进而定向修复了移码突变。
【关键词】：PEAR 修饰性寡核苷酸 同源重组 移码突变 回复突变
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 PEAR技术制备修饰性反义寡核昔酸12-50
• 1 前言12-23
• 1.1 反义寡核苷酸12-17
• 1.1.1 反义寡核苷酸的定义12
• 1.1.2 反义寡核苷酸的化学修饰12-17
• 1.1.2.1 磷酸骨架修饰13-14
• 1.1.2.2 碱基修饰14-16
• 1.1.2.3 糖环修饰16-17
• 1.2 其他类型寡核苷酸17-20
• 1.2.1 siRNA17-18
• 1.2.2 三股螺旋寡核苷酸18-19
• 1.2.3 CpG寡核苷酸19
• 1.2.4 核酸配合体19-20
• 1.3 寡核苷酸扩增技术20
• 1.4 寡核苷酸大规模制备技术存在的问题20-21
• 1.5 PEAR技术21-22
• 1.7 核酸质谱分析技术22-23
• 2 研究内容和意义23-24
• 3 材料和方法24-28
• 3.1 实验材料24-25
• 3.2 实验方法25-28
• 3.2.1 PEAR反应25-26
• 3.2.1.1 PEAR反应体系25-26
• 3.2.1.2 PEAR反应程序26
• 3.2.2 PEAR产物PAGE电泳检测26
• 3.2.3 PEAR产物质谱检测26-28
• 3.2.3.1 PEAR产物纯化26
• 3.2.3.2 PEAR产物的完全酶切26-27
• 3.2.3.3 PEAR酶切产物质谱分析27-28
• 4 结果和讨论28-47
• 4.1 结果28-45
• 4.1.1 PEAR扩增修饰性寡核苷酸28-36
• 4.1.1.1 PEAR反应体系中Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶及限制性内切酶PspGI浓度的优化28
• 4.1.1.2 利用Phusion DNA聚合酶,PEAR扩增2'-F-dNTPs修饰的寡核苷酸28-31
• 4.1.1.3 PEAR产物作为“种子”进行二轮扩增31-32
• 4.1.1.4 利用KOD DNA聚合酶扩增2'-F-dNTPs修饰寡核苷酸32-34
• 4.1.1.5 利用KOD DNA聚合酶,PEAR扩增dTTPαS修饰和2 '-F-dATP/dNTPaSs混合修饰寡核苷酸34-36
• 4.1.2 PEAR产物组分的质谱检测36-45
• 4.2 PEAR技术优势45-46
• 4.3 讨论46-47
• 5 结论47-50
• 第二章 移码突变恢复相关研究50-76
• 1 前言50-57
• 1.2 定点诱变50-54
• 1.2.1 定点诱变的概述50-51
• 1.2.2 定点诱变的方法51-52
• 1.2.3 PCR介导的定点诱变52-54
• 1.3 遗传重组54-57
• 1.3.1 同源重组55
• 1.3.2 位点特异性重组55-56
• 1.3.3 转座重组56
• 1.3.4 寡核苷酸介导的遗传重组56-57
• 1.4 回复突变57
• 2 研究内容和意义57-58
• 3 材料和方法58-65
• 3.1 实验材料58
• 3.2 实验方法58-65
• 3.2.1 质粒pBR322 β-内酰胺酶基因移码突变的制备58-63
• 3.2.1.1 质粒pBR322转化E.coli JM109感受态细胞及质粒的提取58-59
• 3.2.1.2 重叠延伸PCR59-61
• 3.2.1.3 PCR产物的双酶切61
• 3.2.1.4 pBR322的双酶切61-62
• 3.2.1.5 酶切产物的连接62
• 3.2.1.6 pBR322/Amp转化E.coliJM109感受态细胞62-63
• 3.2.1.7 测序63
• 3.2.2 寡核苷酸介导的β-内酰胺酶基因功能恢复63-64
• 3.2.2.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-感受态细胞的制备63
• 3.2.2.2 寡核苷酸转化感受态E.coli JM109/pBR322/Amp~-63-64
• 3.2.2.3 统计数据,计算抗性恢复率64
• 3.2.2.4 培养纯化测序64
• 3.2.3 抗性自发恢复菌株测序64-65
• 4 结果与讨论65-76
• 4.1 结果与分析65-73
• 4.1.1 E.coli JM109/pBR322/Amp~-的获得65-69
• 4.1.1.1 E.coli JM109/pBR322的获得65-66
• 4.1.1.2 重叠延伸PCR66-67
• 4.1.1.3 质粒pBR322/Amp~-的构建67-68
• 4.1.1.4 pBR322/Amp~-测序68-69
• 4.1.2 寡核苷酸介导的β-内酰胺酶活性的恢复69-71
• 4.1.3 自然条件下β-内酰胺酶活性的恢复71-73
• 4.2 讨论73-76
• 4.2.1 寡核苷酸介导的同源重组73-75
• 4.2.2 移码突变恢复75-76
• 5 结论76
• 参考文献76-85
• 附录85-96
• 附录Ⅰ 常用溶液配制85-89
• 附录Ⅱ 主要实验仪器89-90
• 附录Ⅲ 常规实验步骤90-93
• 附录Ⅳ 寡核苷酸序列汇总93-94
• 附录Ⅴ DNA及蛋白质序列94-96
• 致谢96-97
• 个人简历97
• 发表的学术论文97

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本文编号：304755