丙酮酸羧化酶在海洋解脂耶罗威亚酵母菌合成柠檬酸中的作用

发布时间：2017-04-14 00:17

  本文关键词：丙酮酸羧化酶在海洋解脂耶罗威亚酵母菌合成柠檬酸中的作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：柠檬酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药与工业领域。目前柠檬酸主要是通过生物发酵的方式获得,其中黑曲霉是工业发酵的主要菌株。然而,黑曲霉发酵产生的废物易污染环境,并且发酵控制技术要求高,对菌株的遗传改造难度也大。在柠檬酸的发酵生产中,解脂耶罗威亚酵母菌能够克服黑曲霉生产中的不足,已经成为近年来研究的热点,作为柠檬酸工业生产菌株也逐渐被人们所认同。在其他人的研究中发现,丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)在有机酸合成方面有着很大的作用。该酶催化丙酮酸形成草酰乙酸,在酵母油脂合成与琥珀酸、α-酮戊二酸以及苹果酸等有机酸积累方面有着重要作用。柠檬酸是草酰乙酸与乙酰CoA通过缩合作用形成的,因此我们认为丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成中也起着某些重要作用。为了进一步研究丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成调控中的作用,本论文分别克隆了季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii) Pcla22菌株和海洋霉菌产红青霉(Penicillium rubens) 1067菌株的丙酮酸羧化酶基因,并将这些基因在解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica) SWJ-1 b菌株中进行了表达。pINA1312质粒是适用于在解脂耶罗威亚酵母(Y.lipolytica)中高效表达外源基因的质粒。但在实际应用中,该质粒由于多克隆位点区域可用的酶切位点过少,在表达外源基因的过程中受到了很大的限制。本研究采用引物人工退火与酶切连接的方法,成功构建pINA1312-GY质粒,在pINA1312质粒上增加3个新的酶切位点,为外源基因在Y. lipolytica中表达构建了方便有效的工具。季也蒙毕赤酵母(P. guilliermondii是一株已全基因组测序的菌株,具有遗传背景清楚和高产有机酸的优点。将一株分离自海洋的季也蒙毕赤酵母Pcla22菌株的丙酮酸羧化酶基因(PYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行了表达。研究发现,转化子PG86的丙酮酸羧化酶酶活和柠檬酸产量都明显高于原始菌株SWJ-1b。在补料发酵条件下,转化子PG86的发酵液柠檬酸浓度为101.0士1.3g/l,糖转化为柠檬酸的得率为0.89g/g。HPLC检测表明发酵产物主要为柠檬酸。这表明丙酮酸羧化酶基因(PYC)得到了超表达,且该酶在柠檬酸合成调控中具有重要作用,超表达丙酮酸羧化酶可以促进柠檬酸的累积。海洋霉菌产红青霉(P.rubens)是一株高产有机酸的菌株,目前对它的研究还很少。本实验采用简并引物和基因组步移的方法,克隆了产红青霉(P.rubens)1067菌株的丙酮酸羧化酶基因及其上下游调控区基因。该菌丙酮酸羧化酶基因(登录号：KM397349.1)ORF框共3534 bp,编码1177个氨基酸,预测的蛋白质分子量为127.531kDa,等电点pI 6.20。启动子位于基因上游-1200 bp位置,包含一个TATAA框、多个CAAt框和5'-SYGGRG-3'序列。该酶无信号肽,为同源四聚体结构(α4),每一单体包含四个功能区域。为了进一步提高柠檬酸产量,将1607菌株的丙酮酸羧化酶基因(RPYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行表达。研究发现,转化子PR32的丙酮酸羧化酶酶活可达0.53 U/mg,高于相同条件下SWJ-1b菌株和PG86菌株的酶活(分别为0.07 U/mg和0.38U/mg)。测定了补料发酵条件下转化子PR32菌株的产柠檬酸能力,发现其发酵液中柠檬酸浓度为111.1±1.3 g/l,糖转化为柠檬酸的得率为0.93 g/g。进一步表明,提高丙酮酸羧化酶酶活力,可以将更多的CO2固定到糖代谢中并生成更多的草酰乙酸,进而草酰乙酸和乙酰CoA合成了更高水平的柠檬酸。
【关键词】：解脂耶罗威亚酵母菌 柠檬酸 丙酮酸羧化酶 基因克隆 分批补料发酵
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第一章 绪论12-32
• 1 柠檬酸12-20
• 1.1 柠檬酸的性质及主要应用12-13
• 1.2 柠檬酸的工业生产13
• 1.3 柠檬酸生产菌株13-18
• 1.4 柠檬酸的生物合成途径18-20
• 2 丙酮酸羧化酶20-30
• 2.1 丙酮酸羧化酶的性质及功能20
• 2.2 丙酮酸羧化酶的结构特征20-21
• 2.3 丙酮酸羧化酶的作用机制21-22
• 2.4 丙酮酸羧化酶在有机酸代谢中的作用22-30
• 3 论文立项依据和研究内容30-32
• 第二章 pINA1312质粒的改造32-38
• 1 前言32
• 2 材料与方法32-35
• 2.1 质粒和菌株32
• 2.2 培养基与试剂32-33
• 2.3 实验方法33-35
• 3 结果与讨论35-37
• 4 本章小结37-38
• 第三章 P.guilliermondii丙酮酸羧化酶基因在Y.lipolitica表达和柠檬酸的小规模生产38-57
• 1 前言38
• 2 材料与方法38-46
• 2.1 质粒和菌株38-39
• 2.2 培养基与试剂39-40
• 2.3 实验方法40-46
• 3 结果与讨论46-55
• 3.1 基因组DNA的提取46-47
• 3.2 P.guilliermondii丙酮酸羧化酶基因表达质粒的构建47-48
• 3.3 转化Y.lipolytica酵母细胞48-49
• 3.4 转化子筛选验证49-51
• 3.5 丙酮酸羧化酶酶活及基因表达水平51-52
• 3.6 葡萄糖浓度的优化52-53
• 3.7 补料分批发酵培养53-54
• 3.8 发酵产物检测54-55
• 4 本章小结55-57
• 第四章 P.rubens丙酮酸羧化酶的基因克隆及生物信息学分析57-70
• 1 前言57-58
• 2 材料与方法58-62
• 2.1 质粒和菌株58
• 2.2 培养基与试剂58
• 2.3 实验方法58-62
• 3 结果与讨论62-69
• 3.1 基因组DNA的提取62-63
• 3.2 简并引物PCR扩增63
• 3.3 基因组步移技术获得丙酮酸羧化酶基因全长63-64
• 3.4 丙酮酸羧化酶基因蛋白序列生物信息学分析64-69
• 4 本章小结69-70
• 第五章 P.rubens丙酮酸羧化酶基因在Y.lipolitica中表达和柠檬酸的小规模生产70-84
• 1 前言70
• 2 材料与方法70-75
• 2.1 质粒和菌株70-71
• 2.2 培养基与试剂71
• 2.3 实验方法71-75
• 3 结果与讨论75-83
• 3.1 P.rubens丙酮酸羧化酶基因表达质粒的构建75-77
• 3.2 转化Y.lipolytica酵母细胞77-78
• 3.3 转化子筛选验证78-79
• 3.4 丙酮酸羧化酶比酶活及基因表达水平79-81
• 3.5 葡萄糖浓度的优化81-82
• 3.6 补料分批发酵培养82-83
• 4 本章小结83-84
• 论文总结与创新点84-86
• 参考文献86-98
• 附录98-99
• 致谢99-100
• 个人简历及发表的学术论文100

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本文编号：304806