灰霉菌红光受体光敏色素基因Bcphy2参与生长发育和致病性的调控

发布时间：2017-04-15 08:21

  本文关键词：灰霉菌红光受体光敏色素基因Bcphy2参与生长发育和致病性的调控，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：光照是一种非常重要的环境因子,能够调控真菌的很多方面,包括生长发育、次生代谢、致病性、以及逆境胁迫等。本文的研究对象灰霉菌(Botrytis cinerea)是一种能侵染200多种已知植物的广寄主性营养坏死型真菌,也是危害程度居世界第二的植物病原菌。前人的研究发现,灰霉菌分生孢子的产生、萌发管的形成、生物量、致病性等均受到光照的调控。因此对灰霉菌光生物学的探究能够为有效控制灰霉菌病害提供一定的理论依据。本实验室前期已经对灰霉菌光敏色素Bcphy3进行了功能研究,报道了Bcphy3缺失以后,生长速率、产孢、细胞壁的完整性以及致病性等方面都发生了改变。本研究通过基因缺失突变等遗传学方法对灰霉菌另一个光敏色素基因Bcphy2的功能进行了分析,研究结果如下：1、对灰霉菌中预测的三个红光受体-光敏色素蛋白进行生物信息学的分析。数据分析表明,BcPHY1、BcPHY2、BcPHY3都属于真菌类光敏色素家族。其中本文的研究对象BcPHY2的N端是由PAS、GAF和PHY三个结构域组成的光感应结构域,C端则由HisKA、HATPase-C和反应调节结构域REC共同组成双组分组氨酸激酶结构域。通过氨基酸序列比对,发现上述六个结构域与其它真菌光敏色素同源性都较高。另外RT-PCR的结果证实,Bcphy2的表达是受到光照调控的。因此,灰霉菌BcPHY2可能行使光受体功能。2、采用同源重组策略对灰霉菌光敏色素基因Bcphy2进行敲除,共获得了85株具有潮霉素抗性的转化子,经基因组水平、转录组水平和Southern bolt鉴定后,最终获得2株Bcphy2缺失的突变体,命名为ΔBcphy2-28。和ΔBcphy2-58。3、Bcphy2对生长发育的影响：与野生型B05.10相比,ΔBcphy2-28和ΔBcphy2-58在各种培养基上生长变快,菌丝生物量积累显著增加,产孢减少。通过测定菌丝中几丁质含量和黑色素含量,可以证明ΔBcphy2-28和ΔBcphy2-58的细胞壁结构发生了变化,黑色素的积累减少。表明光敏色素基因Bcphy2在调控灰霉菌的生长发育中发挥了非常重要的作用。4、Bcphy2对致病性的影响：与野生型B05.10相比,ΔBcphy2-28和ABcphy2-58在洋葱、青椒、番茄、青提、苹果、拟南芥和烟草叶片等不同寄主上的致病性都显著增强。进一步分析其致病性增强的原因发现：在离体培养条件下,ΔBcphy2-28和△Bcphy2-5S分泌的细胞壁降解酶(多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、蛋白酶)、活性氧、以及酸化周围环境的能力都显著增加,且对寄主细胞壁成分的利用能力也更强,表明光敏色素基因Bcphy2参与了灰霉菌致病性的调控。5、Bcphy2在灰霉菌光感应中的功能：红光能显著促进对野生型B05.10的生长,蓝光却抑制其生长。而Bcphy2缺失突变体在红光下的生长速率与黑暗没有显著差异。红光可促进B05.10大量产孢和产生黑色素,而ABcphy2-28和ABcphy2-58在红光下分生孢子的产生和黑色素的积累明显减少,但与黑暗相比,红光的促进作用并没有完全消失。表明Bcphy2很可能与另外两个光敏色素基因共同调控灰霉菌对红光的感应。此外,光暗下拟南芥和烟草叶片侵染实验证实Bcphy2参与了光照抑制灰霉菌致病性的过程。6、BcPHY2作为双组分组氨酸激酶在逆境胁迫中的作用：与野生型B05.10相比,ΔBcphy2-28和ΔBcphy2-58对葡萄糖、山梨醇引起的渗透胁迫,KCl引起的离子胁迫,H2O2引起的氧化胁迫敏感性都增强,但对刚果红引起的细胞壁胁迫敏感性降低。综上所述,灰霉菌光敏色素基因Bcphy2在生长发育、致病性以及逆境胁迫中都发挥了非常重要的作用,并且可能作为红光受体参与了灰霉菌的光形态建成。
【关键词】：灰霉菌 光敏色素 光受体 生长发育 致病性
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 综述12-22
• 1. 光照对真菌的影响12-14
• 2. 光敏色素研究进展14-18
• 2.1 植物光敏色素14-15
• 2.2 原核生物光敏色素15-16
• 2.3 真菌光敏色素16-18
• 3. 光对灰霉菌影响的研究18-20
• 4. 本论文的研究目的和意义20-22
• 1. 引言22-24
• 2. 材料与方法24-39
• 2.1 材料24-28
• 2.1.1 实验菌株与培养条件24
• 2.1.2 培养基及配方24-27
• 2.1.3 光源27
• 2.1.4 引物信息27-28
• 2.2 方法28-39
• 2.2.1 融合PCR获得转化片段28
• 2.2.2 PEG介导的原生质体转化法28-30
• 2.2.3 转化子的筛选与传代30
• 2.2.4 CTAB法提取DNA30
• 2.2.5 Trizol法提取RNA30-31
• 2.2.6 小量提取质粒DNA31
• 2.2.7 转化子基因组水平和转录水平的鉴定31-32
• 2.2.8 Southern blots鉴定转化子32-34
• 2.2.9 生长速率与生物量的测定34
• 2.2.10 细胞壁几丁质含量的测定34-35
• 2.2.11 电镜观察细胞壁35-36
• 2.2.12 不同光照下产孢量的测定36
• 2.2.13 反接种实验36
• 2.2.14 DAB(二氨基联苯胺)染色法检测活性氧(ROS)的产生36-37
• 2.2.15 多聚半乳糖醛酸酶、纤维素酶、蛋白酶分泌的测定37
• 2.2.16 酸化能力的检测37
• 2.2.17 不同pH值对生长的影响37
• 2.2.18 抵抗逆境胁迫能力的检测37-39
• 3. 结果与分析39-67
• 3.1 灰霉菌光敏色素基因Bcphy2的生物信息学分析与对光照的感应39-43
• 3.1.1 灰霉菌光敏色素基因Bcphy2的生物信息学分析39-43
• 3.1.2 灰霉菌光敏色素基因Bcphy2对光的感应43
• 3.2 灰霉菌光敏色素基因Bcphy2缺失突变体△Bcphy2的获得43-45
• 3.2.1 转化子的基因组水平鉴定43-44
• 3.2.2 转化子的转录组水平鉴定44
• 3.2.3 转化子的Southern blots鉴定44-45
• 3.3 光敏色素基因Bcphy2对灰霉菌生长发育的影响45-52
• 3.3.1 光敏色素基因Bcphy2缺失对菌落形态的影响45-47
• 3.3.2 光敏色素基因Bcphy2缺失对生长速率的影响47-49
• 3.3.3 光敏色素基因Bcphy2缺失对生物量的影响49-50
• 3.3.4 光敏色素基因Bcphy2缺失对细胞壁的影响50
• 3.3.5 光敏色素基因Bcphy2缺失对菌丝尖端的影响50-51
• 3.3.6 光敏色素基因Bcphy2缺失对黑色素积累的影响51-52
• 3.4 光敏色素基因Bcphy2对致病性的影响52-58
• 3.4.1 不同寄主上致病性的比较52-53
• 3.4.2 Bcphy2缺失后致病性增强原因探讨53-58
• 3.5 光敏色素基因Bcphy2参与灰霉菌对逆境胁迫的调控58-59
• 3.6 光敏色素基因Bcphy2参与光感应59-67
• 3.6.1 不同光照条件下的菌落形态59-61
• 3.6.2 不同光照下生长速率的比较61
• 3.6.3 不同光照下产孢量的差异61-63
• 3.6.4 不同光照下黑色素积累的比较63-65
• 3.6.5 光暗下致病性的比较65-67
• 4. 讨论67-71
• 4.1 Bcphy2的生物信息学分析及功能预测67
• 4.2 Bcphy2作为光敏色素对光照的响应67-68
• 4.3 Bcphy2参与逆境胁迫的调控68-69
• 4.4 Bcphy2的缺失对灰霉菌生长发育的影响69
• 4.5 Bcphy2的缺失对致病性的影响及原因探讨69-71
• 5. 结论与展望71-74
• 5.1 结论71-72
• 5.2 展望72-74
• 参考文献74-80
• 致谢80-81
• 个人简历81

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 王昌禄;张晓伟;陈勉华;周庆礼;王莹;蒿露;傅志良;班昭;;红光对红曲霉生长及次级代谢产物的影响[J];天然产物研究与开发;2009年01期

2 刘圈炜,何云,齐胜利,王成章,陈继红,潘俊良,王彦华;光敏色素研究进展[J];中国农学通报;2005年05期

3 李建波,宋欣,曲音波;产胞外黑色素菌株的筛选[J];微生物学通报;2004年01期

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1 何金燕;灰霉菌光敏色素基因Bcphy3的功能分析[D];华东师范大学;2014年

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本文编号：307935