NCD偏好性的突变型FNR的筛选及其性能研究
发布时间：2021-04-01 19:16
光自养生物光系统末端的铁氧还蛋白-NADP还原酶（FNR）,利用光合作用产生的电子再生NADPH,为生物合成提供还原力。但NADPH作为天然辅酶,参与众多胞内代谢途径,无法选择性地将还原力传递到目标途径,降低了还原力利用效率及可控性。人工辅酶烟酰胺胞嘧啶二核苷酸（NCD）具有NAD（P）的还原力传递能力,同时不被天然代谢途径识别,可降低代谢系统复杂性,将还原力特异性地传递给目标途径。本论文结合FNR结构分析、高通量筛选方法设计,通过蛋白定向进化策略对,Synechocystis sp.PCC 6803来源的FNR进行突变改造,筛选具有NCD偏好性的FNR突变型,利用光合作用产生的还原力再生NCDH,以实现还原力的选择性传递。同时针对NCD无法胞内合成且跨膜运输效率低的问题,建立高效NCD转运策略。取得主要成果如下:建立基于辅酶循环显色的高通量活性检测方法以及基于HpaB-FNR融合蛋白的平板显色高通量筛选策略。通过模拟及分析FNR结构,确定了 10个可能影响FNR辅酶偏好性的活性位点。建立对应的单位点饱和突变文库、双位点饱和突变文库与随机突变文库。筛选了4个单位点饱和突变文库、9个双位...
【文章来源】：东北电力大学吉林省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＮＡＤ与ＮＣＤ结构示意图??
５，还原生成ＦＡＤＨ２，而??后通过氧化ＦＡＤＨ２，将还原力进一步传递给ＮＡＤＰ，生成ＮＡＤＰＨ［２６］。相关研宄表明，ＦＮＲ??不单单参与ＮＡＤＰＨ的再生，还参与了光合作用ＰＳＩ中的电子循环流动。这种电子流动的??转移，不会生成ＮＡＤＰＨ，但会促进ＡＴＰ的合成。研宄者认为，ＦＮＲ?—定程度上促进了??ＡＴＰ的积累，为植物固定Ｃ〇２提供了能量。??ＮＡＤＰ＊?－Ｈ?Ｚ?目??ｋＮＡＤＰＨ〈??＼餘錄??ｌ．祕錄????—：：：：二：二心一＿＿———?ＡＴＰ??图１－２光电子传递示意图??１．４．?２?ＦＮＲ的应用??ＦＮＲ可利用光合作用产生的还原力，还原再生ＮＡＤＰＨ，因此，对ＦＮＲ的相关研究主??要集中在强化光合作用效率这一方面。Ｌｕｏ等人通过构建ＦＮＲ的表达载体，于办??ｓｐ．?ＰＣＣ?６８０３体内过表达ＦＮＲ蛋白，强化ＮＡＤＰＨ的合成，使ＮＡＤＰＨ浓度提高了?８０．８％［２７］。??Ｄｉａｋｏｎｏｖａ等人通过研宄ＦＮＲ与Ｆｄ相互间的静电作用，发现当ｐＨ由６增加到８时，ＦＮＲ??与Ｆｄ之间的电子传递速率提高了?３倍，提高了胞内ＮＡＤＰＨ的合成ｆ２８ｌ?Ｙｕ等人通过在真??核藻类体内表达异源ＦＮＲ，研究高盐胁迫条件下ＦＮＲ与电子传递的联系与调控机制，该??研究为强化ＮＡＤＰＨ的还原再生提供了理论基础［２９］。利用ＦＮＲ催化辅酶再生的性质，可??用于异源代谢途径的辅酶调控。ＫｙＨａｋａｋｉｓ等人基于ＦＮＲ介导Ｆｄ与ＮＡＤＰ氧化还原的特??性，利用ＦＮＲ构建辅酶循环，成功建立异源代谢体系＠１。蛋白的结构特征决定其功能，??加强对ＦＮＲ蛋白结构的研究，有助于强化光合作用。Ｇｒｚｙｂ等人使用大肠杆菌表达?
第２章实验材料与方法??３５??３０?＿??Ｉ＂：??９?ｙ＝１．５２６５ｘ??ｇ?１０?■?Ｒ２?＝?０?？卿?２??５??０?ｉ＾－?．?．???，??０?５?１０?１５?２０??ＡＡ＾７＾ｍｉｎ??图２－１?ＮＡＤ标准曲线??８??Ｊ－??？Ｓ?５?ｙ?＝?６．７５９９ｘ?＋０．６２２３??Ｍ?Ｒ２?＝?０．９９３５??Ｃ，＾??０?０２?０．４?０．６?０．８?１?１２??ＡＡｊ７〇ｎｉｉｎ??图２－２ＮＣＤ标准曲线??－２３－??
【参考文献】：
期刊论文
[1]工业微生物中NADH的代谢调控[J]. 秦义,董志姚,刘立明,陈坚. 生物工程学报. 2009(02)
[2]细胞透性化技术及其应用[J]. 周帅,王凤山. 生命的化学. 2008(04)
本文编号：3113846
【文章来源】：东北电力大学吉林省
【文章页数】：63 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１?ＮＡＤ与ＮＣＤ结构示意图??
５，还原生成ＦＡＤＨ２，而??后通过氧化ＦＡＤＨ２，将还原力进一步传递给ＮＡＤＰ，生成ＮＡＤＰＨ［２６］。相关研宄表明，ＦＮＲ??不单单参与ＮＡＤＰＨ的再生，还参与了光合作用ＰＳＩ中的电子循环流动。这种电子流动的??转移，不会生成ＮＡＤＰＨ，但会促进ＡＴＰ的合成。研宄者认为，ＦＮＲ?—定程度上促进了??ＡＴＰ的积累，为植物固定Ｃ〇２提供了能量。??ＮＡＤＰ＊?－Ｈ?Ｚ?目??ｋＮＡＤＰＨ〈??＼餘錄??ｌ．祕錄????—：：：：二：二心一＿＿———?ＡＴＰ??图１－２光电子传递示意图??１．４．?２?ＦＮＲ的应用??ＦＮＲ可利用光合作用产生的还原力，还原再生ＮＡＤＰＨ，因此，对ＦＮＲ的相关研究主??要集中在强化光合作用效率这一方面。Ｌｕｏ等人通过构建ＦＮＲ的表达载体，于办??ｓｐ．?ＰＣＣ?６８０３体内过表达ＦＮＲ蛋白，强化ＮＡＤＰＨ的合成，使ＮＡＤＰＨ浓度提高了?８０．８％［２７］。??Ｄｉａｋｏｎｏｖａ等人通过研宄ＦＮＲ与Ｆｄ相互间的静电作用，发现当ｐＨ由６增加到８时，ＦＮＲ??与Ｆｄ之间的电子传递速率提高了?３倍，提高了胞内ＮＡＤＰＨ的合成ｆ２８ｌ?Ｙｕ等人通过在真??核藻类体内表达异源ＦＮＲ，研究高盐胁迫条件下ＦＮＲ与电子传递的联系与调控机制，该??研究为强化ＮＡＤＰＨ的还原再生提供了理论基础［２９］。利用ＦＮＲ催化辅酶再生的性质，可??用于异源代谢途径的辅酶调控。ＫｙＨａｋａｋｉｓ等人基于ＦＮＲ介导Ｆｄ与ＮＡＤＰ氧化还原的特??性，利用ＦＮＲ构建辅酶循环，成功建立异源代谢体系＠１。蛋白的结构特征决定其功能，??加强对ＦＮＲ蛋白结构的研究，有助于强化光合作用。Ｇｒｚｙｂ等人使用大肠杆菌表达?
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【参考文献】：
期刊论文
[1]工业微生物中NADH的代谢调控[J]. 秦义,董志姚,刘立明,陈坚. 生物工程学报. 2009(02)
[2]细胞透性化技术及其应用[J]. 周帅,王凤山. 生命的化学. 2008(04)
本文编号：3113846
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