致病杆菌重组系统的建立和次级代谢产物基因簇的研究
发布时间：2021-04-13 08:02
致病杆菌属（Xenorhabdus sp.）是肠杆菌科一类与斯氏线虫属（Steinernema sp.）互利共生的革兰氏阴性细菌,能产生大量具有杀虫、抑菌、抗肿瘤等生物活性的次级代谢产物。基于对致病杆菌HNxs01基因组测序以及生物信息学分析,发现基因组中存在大量的隐性基因簇,而目前对致病杆菌次级代谢产物的研究缺乏有效的基因编辑方法,从而阻碍了新天然产物的发现。Red/ET同源重组技术通过短同源臂以及重组酶能够高效的促进双链断裂修复和瞬间重组,重组效率高,逐渐成为基因功能探索以及新菌株构建的有力手段。本研究旨在以Red/ET同源重组原理为基础,基于致病杆菌全基因组测序结果,应用致病杆菌自身噬菌体的重组酶在致病杆菌HNxs01中建立和优化新型重组酶系统,以便高效快捷地进行次级代谢产物的挖掘。主要研究结果如下:（1）致病杆菌和气单胞菌重组系统的研究。通过将致病杆菌和杀鲑气单胞菌的基因组及噬菌体基因与Red/ET同源重组蛋白进行Blast比对,在致病杆菌中获得了Redα、Redβ的同源蛋白,在气单胞菌中获得了RecE、Rec T、Redγ的同源蛋白...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Red/ET重组系统示意图
硕士学位论文6证获得正确的重组子（图1-2）。直接克隆可以高效准确的从大肠杆菌，酵母或小鼠胚胎干细胞中纯化的总基因组DNA中获取目的DNA。直接克隆在挖掘新的天然产物的生物合成基因簇或提高细菌的化合物产量中有着重要的潜在作用。Bian通过RecE/RecT介导的LLHR从丁香假单胞菌的基因组DNA直接克隆丁香脂素基因簇，并在大肠杆菌中表达，由此发现了两个新的丁香脂素家族成员[55]。Liu通过Red/ET重组直接克隆天然产物生物合成基因簇（BGCs）并在枯草芽孢中成功表达了细菌霉素的基因簇[56]。迄今为止，已经使用该方法克隆了几种基因簇并进行了异源表达，包括发光素（luminmycin）[57],丁香脂素（syringolin）[55],格列巴丁（glidobactin）[58],colibactin[59],sevadicin[60],以及沙利霉素（salinomycin）[61]基因簇。图1-2直接克隆流程图[6]Figure1-2Directcloningflowchart[6]（3）亚克隆：指从细菌的染色体或质粒上，通过Red/ET重组技术，亚克隆特定的DNA片段到合适的载体上。首先构建带有一个质粒复制起始位点（ori）和一个抗生素选择标记（sm）基因，以及两侧是两个寡核苷酸同源臂的线性克隆载体。接着将克隆载体转入表达Red/ET同源重组酶的大肠杆菌中，通过同源配对，与细菌内质粒、染色体或其他片段的特定DNA序列发生重组，形成稳定的环状质粒以在大肠杆菌中稳定复制（图1-3）。选择复制载体时，需选择可容纳合适目的片段大小的质粒，不能超过质粒复制子所容纳的最大承载量，否则很大可能会导致重组失败。亚克隆与直接克隆相似的是，都需要构建一个线性载体克隆目的片段，都可在RecE和RecT重组酶的介导下发生重组。不同的是，直接克隆是将线性载体和待克隆的目的片段在体外构建并同时转入含有Red/ET重组酶的大肠杆菌中，而亚克隆是只将线
┝烁?玫闹С帧Ｖ虏「司?男捅渚哂锌赡嫘裕?雹裥妥?湮??型后，在一定的培养条件下，Ⅱ型可以重新转变为Ⅰ型[74]。这两种变体在形态以及生长特性等方面存在明显的差异，可以通过以下几个特征来区分：（1）菌落形态，I型变体在营养琼脂（NA）培养基上呈现白色不透明、菌落形态孝湿润，II型变体菌落则是白色半透明、菌落形态较大、较干燥。（2）吸附染料，Ⅰ型变体可以在琼脂平板上吸附染料，例如在溴百里酚蓝营养琼脂培养基（NBTA）生长时，由于摄取溴百里酚蓝菌落呈现蓝色或蓝绿色，而在II型变体不能吸附染料而呈现白色（图1-4A）。（3）产酶能力，Ⅰ型变体可以产生磷脂酶（卵磷脂酶），而II型变体不能产生。（4）运动性，Ⅰ型变体具有鞭毛，在半固体培养基（0.6至1.2％琼脂）上生长时会出现成群运动，并且能快速的协调种群迁移周期，因此更能稳定的在线虫中生长，并帮助线虫更好的适应环境，生长，繁殖；而II型变体无法在半固体琼脂中运动，同样在嗜线虫中生长时也无法游动（图1-4B）。（5）抗生素的产生，Ⅰ型变异体可以产生在琼脂上扩散的化学抗生素，能最大程度地减少其他微生物对尸体的二次入侵，而II型变体则不产生此类化合物。图1-4致病杆菌变异体形态差异Figure1-4MorphologicaldifferencesofXenorhabdus（A）致病杆菌Ⅰ型变体在NBTA培养基生长形态。（B）半固体琼脂平板上生长的嗜线虫致病杆菌变异体的形态学观察[74]；a:I型变体；b：II型变体。
【参考文献】：
期刊论文
[1]苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立[J]. 李宇晟,张旭,胡晓凤,丁学知,夏立秋,胡胜标. 湖南师范大学自然科学学报. 2013(02)
[2]嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立[J]. 魏明敏,邱德文,曾洪梅,黄建新,杨秀芬,袁京京. 生物技术通报. 2009(04)
硕士论文
[1]嗜线虫致病杆菌YL001cpxR基因敲除对其抑菌活性及生长代谢的影响[D]. 汤倩.西北农林科技大学 2015
[2]昆虫病原线虫共生菌的分离及其活性和肿瘤靶向性研究[D]. 张超.湖南师范大学 2012
本文编号：3134930
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：83 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Red/ET重组系统示意图
硕士学位论文6证获得正确的重组子（图1-2）。直接克隆可以高效准确的从大肠杆菌，酵母或小鼠胚胎干细胞中纯化的总基因组DNA中获取目的DNA。直接克隆在挖掘新的天然产物的生物合成基因簇或提高细菌的化合物产量中有着重要的潜在作用。Bian通过RecE/RecT介导的LLHR从丁香假单胞菌的基因组DNA直接克隆丁香脂素基因簇，并在大肠杆菌中表达，由此发现了两个新的丁香脂素家族成员[55]。Liu通过Red/ET重组直接克隆天然产物生物合成基因簇（BGCs）并在枯草芽孢中成功表达了细菌霉素的基因簇[56]。迄今为止，已经使用该方法克隆了几种基因簇并进行了异源表达，包括发光素（luminmycin）[57],丁香脂素（syringolin）[55],格列巴丁（glidobactin）[58],colibactin[59],sevadicin[60],以及沙利霉素（salinomycin）[61]基因簇。图1-2直接克隆流程图[6]Figure1-2Directcloningflowchart[6]（3）亚克隆：指从细菌的染色体或质粒上，通过Red/ET重组技术，亚克隆特定的DNA片段到合适的载体上。首先构建带有一个质粒复制起始位点（ori）和一个抗生素选择标记（sm）基因，以及两侧是两个寡核苷酸同源臂的线性克隆载体。接着将克隆载体转入表达Red/ET同源重组酶的大肠杆菌中，通过同源配对，与细菌内质粒、染色体或其他片段的特定DNA序列发生重组，形成稳定的环状质粒以在大肠杆菌中稳定复制（图1-3）。选择复制载体时，需选择可容纳合适目的片段大小的质粒，不能超过质粒复制子所容纳的最大承载量，否则很大可能会导致重组失败。亚克隆与直接克隆相似的是，都需要构建一个线性载体克隆目的片段，都可在RecE和RecT重组酶的介导下发生重组。不同的是，直接克隆是将线性载体和待克隆的目的片段在体外构建并同时转入含有Red/ET重组酶的大肠杆菌中，而亚克隆是只将线
┝烁?玫闹С帧Ｖ虏「司?男捅渚哂锌赡嫘裕?雹裥妥?湮??型后，在一定的培养条件下，Ⅱ型可以重新转变为Ⅰ型[74]。这两种变体在形态以及生长特性等方面存在明显的差异，可以通过以下几个特征来区分：（1）菌落形态，I型变体在营养琼脂（NA）培养基上呈现白色不透明、菌落形态孝湿润，II型变体菌落则是白色半透明、菌落形态较大、较干燥。（2）吸附染料，Ⅰ型变体可以在琼脂平板上吸附染料，例如在溴百里酚蓝营养琼脂培养基（NBTA）生长时，由于摄取溴百里酚蓝菌落呈现蓝色或蓝绿色，而在II型变体不能吸附染料而呈现白色（图1-4A）。（3）产酶能力，Ⅰ型变体可以产生磷脂酶（卵磷脂酶），而II型变体不能产生。（4）运动性，Ⅰ型变体具有鞭毛，在半固体培养基（0.6至1.2％琼脂）上生长时会出现成群运动，并且能快速的协调种群迁移周期，因此更能稳定的在线虫中生长，并帮助线虫更好的适应环境，生长，繁殖；而II型变体无法在半固体琼脂中运动，同样在嗜线虫中生长时也无法游动（图1-4B）。（5）抗生素的产生，Ⅰ型变异体可以产生在琼脂上扩散的化学抗生素，能最大程度地减少其他微生物对尸体的二次入侵，而II型变体则不产生此类化合物。图1-4致病杆菌变异体形态差异Figure1-4MorphologicaldifferencesofXenorhabdus（A）致病杆菌Ⅰ型变体在NBTA培养基生长形态。（B）半固体琼脂平板上生长的嗜线虫致病杆菌变异体的形态学观察[74]；a:I型变体；b：II型变体。
【参考文献】：
期刊论文
[1]苏云金芽胞杆菌高效电转化方法的建立[J]. 李宇晟,张旭,胡晓凤,丁学知,夏立秋,胡胜标. 湖南师范大学自然科学学报. 2013(02)
[2]嗜线虫致病杆菌Xna基因同源重组载体的构建及遗传转化体系的建立[J]. 魏明敏,邱德文,曾洪梅,黄建新,杨秀芬,袁京京. 生物技术通报. 2009(04)
硕士论文
[1]嗜线虫致病杆菌YL001cpxR基因敲除对其抑菌活性及生长代谢的影响[D]. 汤倩.西北农林科技大学 2015
[2]昆虫病原线虫共生菌的分离及其活性和肿瘤靶向性研究[D]. 张超.湖南师范大学 2012
本文编号：3134930
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