小球藻病毒来源启动子活性分析及在苏氨酸生物合成中应用
发布时间：2021-04-13 15:56
对大肠杆菌等平台生物的代谢途径进行改造,积累有用代谢产物是现代发酵工程和合成生物学的核心内容。启动子是基因调控和代谢途径改造的重要调控元件,通过改变启动子的启动活性可以调控目的基因的转录水平以积累代谢产物。本实验室的前期工作用鸟枪法从小球藻病毒基因组随机片段中筛选到一组小球藻病毒强启动子N63,N37,N40;利用RT-qPCR检测了这些启动子控制下的报告基因转录文本丰度,用RACE-PCR确定了转录起始位点,推测了-10区和-35区核心结构,并对这些启动子进行截短等突变。通过PCR等分子生物学技术将各突变启动子连接于启动子探测质粒pKK232-8上,使其可以表达氯霉素乙酰转移酶基因cat。之后将携带各小球藻病毒来源强启动子重组质粒转化菌株培养于含有450μg/mL的LB培养基中进行生长曲线测定来间接分析上述启动子的转录调控活性。本研究从大肠杆菌基因组扩增lacZ基因并与经密码子优化的egfp基因通过Overlap PCR融合,两者之间插入氯霉素乙酰转移酶基因cat的RBS序列,构建由已知细菌强启动子tac或从生长曲线实验中挑选的小球藻病毒强启动子控制的人工操纵子,替代启动子探测质粒p...
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌苏氨酸生物合成代谢网络Fig.1ThreoninebiosynthesisandmetabolismnetworkofEscherichiacoli
第1章综述7单，基因编辑效率最为高效，应用也最为广泛。CRISPR系统主要通过crRNA和tracrRNA引导Cas(CRISPR-associatedsystem)蛋白来实现功能[57]。进一步通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将二者连接在一起形成sgRNA(singleguideRNA)，融合后的RNA与野生型RNA具有同样的功能。sgRNA是CRISPR-Cas9基因编辑系统中DNA的靶向片段[58]。利用CRISPR-Cas9在基因靶点位置形成DSB缺口，进而激活了细胞DNA的同源重组修复机制。介导外源DNA靶向编辑[59]。基于此原理可以对基因组的特定位点进行基因敲除、基因替换等各种遗传操作。CRISPR-Cas9基因组编辑技术存着不同程度的脱靶现象[60]。主要是sgRNA选择不当的问题，通过软件分析脱靶位点可以有效降低sgRNA的脱靶率；CRISPR-Cas9系统脱靶效应还与PAM序列有关，PAM序列为NGG时的编辑效率最高[61]。图2CRISPR/Cas9介导的基因组编辑模式图Fig.2CRISPR/cas9mediatedgenomeeditingpattern1.9研究意义启动子是基因表达系统中的重要组成元件，是基因转录的开关。因此强启动子的筛选对于代谢产物的积累意义重大。本研究应用多种分子生物学技术对小球藻病毒来源强启动子的启动活性进行检测。最终筛选得到多个具有强启动活性的启动子用作后续实验。通过构建lacZ-egfp双报告基因串联表达载体来对筛选得到的小球藻病毒强启动子进行进一步研究。通过启动子对双报告基因的转录水平，翻译水平和蛋白质水平的比较进而确定活性强弱[64,65]。目前还未发现将lacZ-egfp双报告基因应用于小球藻病毒强启动子筛选及以大肠杆菌为载体进行启动活性检测的研
第3章突变启动子的构建及生长曲线实验17第3章突变启动子的构建及生长曲线实验3.1试验方法3.1.1突变型启动子重组质粒构建3.1.1.1N63突变型启动子重组质粒构建利用前期RACEPCR结果确定启动子N63的转录起始位点、-10、-35区以后，本研究参考tac的保守区域和特点对启动子N63进行截短突变以及-10区和-35区突变。突变示意图见图3，图中N63WT代表野生型N63启动子，其他为突变型启动子。图3N63启动子突变示意图Fig.3DiagramofN63promotermutationN63-2启动子是在N63野生型启动子的基础上进行截短突变获得的启动子，在-35区前只保留了4个碱基；N63-3是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-10区和-35替换为tac启动子的-10区和-35区获得的启动子；N63-4是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-10区替换tac启动子的-10区，-35区维持不变获得的启动子；N63-5是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-35区替换tac启动子的-35区，-10区维持不变获得的启动子。
【参考文献】：
期刊论文
[1]杀鲑气单胞菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 刘帅,卢彤岩,王荻,曹永生,贾钟贺,王渊博,李绍戊. 基因组学与应用生物学. 2017(07)
[2]酿酒酵母人工杂合启动子与天然启动子活性比较[J]. 唐瑞琪,熊亮,白凤武,赵心清. 生物技术通报. 2017(01)
[3]短小芽孢杆菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选[J]. 贺婷停,宋婷,王超,张长斌,王海燕. 生物技术通报. 2016(11)
[4]利用CRISPR/Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体[J]. 陈韵如,王湘秀,李绍娟,刘桂芬. 基因组学与应用生物学. 2016(06)
[5]产甲烷古菌中CRISPR簇的研究[J]. 方静,侯佳林,张宇,王风平,何莹. 微生物学通报. 2016(11)
[6]猪β防御素2胁迫下大肠杆菌内参基因的稳定性分析[J]. 张坤,张恒,于志明,陈锐博,郑振宇,李春丽. 河南农业大学学报. 2016(01)
[7]CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J]. 谢胜松,张懿,张利生,李广磊,赵长志,倪攀,赵书红. 遗传. 2015(11)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[9]产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及诱变育种[J]. 梁金钟,李雯,王风青. 食品科学. 2013(23)
[10]基于CTC-流式细胞仪活性细菌总数的快速检测技术研究[J]. 林怡雯,杨天,李丹,何苗. 环境科学学报. 2013(09)
本文编号：3135591
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：84 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
大肠杆菌苏氨酸生物合成代谢网络Fig.1ThreoninebiosynthesisandmetabolismnetworkofEscherichiacoli
第1章综述7单，基因编辑效率最为高效，应用也最为广泛。CRISPR系统主要通过crRNA和tracrRNA引导Cas(CRISPR-associatedsystem)蛋白来实现功能[57]。进一步通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将二者连接在一起形成sgRNA(singleguideRNA)，融合后的RNA与野生型RNA具有同样的功能。sgRNA是CRISPR-Cas9基因编辑系统中DNA的靶向片段[58]。利用CRISPR-Cas9在基因靶点位置形成DSB缺口，进而激活了细胞DNA的同源重组修复机制。介导外源DNA靶向编辑[59]。基于此原理可以对基因组的特定位点进行基因敲除、基因替换等各种遗传操作。CRISPR-Cas9基因组编辑技术存着不同程度的脱靶现象[60]。主要是sgRNA选择不当的问题，通过软件分析脱靶位点可以有效降低sgRNA的脱靶率；CRISPR-Cas9系统脱靶效应还与PAM序列有关，PAM序列为NGG时的编辑效率最高[61]。图2CRISPR/Cas9介导的基因组编辑模式图Fig.2CRISPR/cas9mediatedgenomeeditingpattern1.9研究意义启动子是基因表达系统中的重要组成元件，是基因转录的开关。因此强启动子的筛选对于代谢产物的积累意义重大。本研究应用多种分子生物学技术对小球藻病毒来源强启动子的启动活性进行检测。最终筛选得到多个具有强启动活性的启动子用作后续实验。通过构建lacZ-egfp双报告基因串联表达载体来对筛选得到的小球藻病毒强启动子进行进一步研究。通过启动子对双报告基因的转录水平，翻译水平和蛋白质水平的比较进而确定活性强弱[64,65]。目前还未发现将lacZ-egfp双报告基因应用于小球藻病毒强启动子筛选及以大肠杆菌为载体进行启动活性检测的研
第3章突变启动子的构建及生长曲线实验17第3章突变启动子的构建及生长曲线实验3.1试验方法3.1.1突变型启动子重组质粒构建3.1.1.1N63突变型启动子重组质粒构建利用前期RACEPCR结果确定启动子N63的转录起始位点、-10、-35区以后，本研究参考tac的保守区域和特点对启动子N63进行截短突变以及-10区和-35区突变。突变示意图见图3，图中N63WT代表野生型N63启动子，其他为突变型启动子。图3N63启动子突变示意图Fig.3DiagramofN63promotermutationN63-2启动子是在N63野生型启动子的基础上进行截短突变获得的启动子，在-35区前只保留了4个碱基；N63-3是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-10区和-35替换为tac启动子的-10区和-35区获得的启动子；N63-4是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-10区替换tac启动子的-10区，-35区维持不变获得的启动子；N63-5是在截短突变的N63-2启动子的基础上将原本N63启动子的-35区替换tac启动子的-35区，-10区维持不变获得的启动子。
【参考文献】：
期刊论文
[1]杀鲑气单胞菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用[J]. 刘帅,卢彤岩,王荻,曹永生,贾钟贺,王渊博,李绍戊. 基因组学与应用生物学. 2017(07)
[2]酿酒酵母人工杂合启动子与天然启动子活性比较[J]. 唐瑞琪,熊亮,白凤武,赵心清. 生物技术通报. 2017(01)
[3]短小芽孢杆菌实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选[J]. 贺婷停,宋婷,王超,张长斌,王海燕. 生物技术通报. 2016(11)
[4]利用CRISPR/Cas9构建稳定遗传的斑马鱼WHSC1L1纯合突变体[J]. 陈韵如,王湘秀,李绍娟,刘桂芬. 基因组学与应用生物学. 2016(06)
[5]产甲烷古菌中CRISPR簇的研究[J]. 方静,侯佳林,张宇,王风平,何莹. 微生物学通报. 2016(11)
[6]猪β防御素2胁迫下大肠杆菌内参基因的稳定性分析[J]. 张坤,张恒,于志明,陈锐博,郑振宇,李春丽. 河南农业大学学报. 2016(01)
[7]CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估[J]. 谢胜松,张懿,张利生,李广磊,赵长志,倪攀,赵书红. 遗传. 2015(11)
[8]CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 李聪,曹文广. 生物工程学报. 2015(11)
[9]产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选及诱变育种[J]. 梁金钟,李雯,王风青. 食品科学. 2013(23)
[10]基于CTC-流式细胞仪活性细菌总数的快速检测技术研究[J]. 林怡雯,杨天,李丹,何苗. 环境科学学报. 2013(09)
本文编号：3135591
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