热纤梭菌纤维小体调控因子的结构和功能研究
发布时间：2021-05-18 19:15
热纤梭菌（Clostridium thermocellum）是目前自然界中已知的降解木质纤维素最高效的微生物之一,是利用木质纤维素生产生物能源和化学品的理想菌株。热纤梭菌拥有高效的多酶复合体称为纤维小体,可以将植物细胞壁中的多糖分解成可溶性的糖。已有的研究发现,热纤梭菌纤维小体的组成受到细胞外底物种类的调控,其调控机制可能是通过多个sigma和anti-sigma因子对来完成的。了解sigma-anti-sigma因子之间的信号传导机制,有助与对纤维小体进行定向改造,开发高效降解木质纤维素的体系。二级结构预测和跨膜预测分析表明,调控纤维小体表达的anti-sigma因子是跨膜蛋白,具有一个胞外的多糖结合结构域,一个跨细胞壁的无序区,一个周质空间结构域,一个跨膜螺旋和一个胞内结构域。本文选择了热纤梭菌ATCC 27405中Cthe0267编码的anti-sigma因子RsgI2作为研究对象,综合利用了分子生物学技术、蛋白质生化技术及核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）技术对RsgI2进行了以下研究：（1）热纤梭菌anti-sig...
【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 纤维小体
1.1.1 脚架蛋白
1.1.2 Cohesin和dockerin模块
1.1.3 酶亚基
1.1.4 纤维小体的多样性
1.2 ECF sigma因子的研究进展
1.2.1 ECF sigma因子属于σ~(70)家族
1.2.2 ECF sigma因子的作用
1.2.3 ECF sigma因子的特点
1.2.4 ECF sigma因子的信号传导机制
1.3 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的研究进展
1.3.1 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的发现
1.3.2 sigma因子的结构特点
1.3.3 anti-sigma因子的结构特点
1.3.4 anti-sigma因子对胞外多糖的特异性识别
1.3.5 anti-sigma与sigma因子的特异性相互作用
1.3.6 sigma因子和纤维小体基因表达的相关性
1.3.7 已有的anti-sigma-sigma因子的调控模型
1.4 蛋白纯化遇到的常见问题
1.4.1 蛋白的稳定性
1.4.2 蛋白的表达量
1.4.3 蛋白纯化方法的选择
1.5 蛋白结构解析的常用方法
1.6 课题研究内容与意义
第二章 热纤梭菌RsgI2胞内结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析
2.1 热纤梭菌anti-sigma因子的选择
2.2 实验材料
2.2.1 质粒与菌株
2.2.2 分子生物学相关试剂
2.2.3 主要仪器一览表(表2-1)
2.3 实验方法
2.3.1 构建含单一目的基因的重组载体
1) 目的片段的获得
2) 载体和目的基因双酶切
3) 载体和目的片段连接
4) 转化克隆菌株DH5α
5) 阳性克隆筛选与测序验证
6) 转化菌株BL21
2.3.2 重组载体的表达与优化
2.3.3 对已构建的载体进行点突变
2.3.4 蛋白纯化方法
2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法
2.3.6 浓缩管的使用
2.3.7 NMR样品的制备
2.3.8 NMR滴定实验
2.3.9 数据的处理、分析及结构计算
2.4 实验结果矛口讨论
2.4.1 RsgI2-ND的表达纯化
1) RsgI2-ND的预表达
2) RsgI2-ND的表达纯化
3) 初步的NMR分析
4) RsgI-ND突变体的表达纯化
2.4.2 化学位移指认
2.4.3 RsgI2-ND(L23D)的结构解析
2.4.4 RsgI2-ND(L23D)与单糖、二糖的作用
2.5 本章小结
第三章 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析
3.1 Cthe 0267编码的anti-sigma因子存在周质空间结构域
3.2 实验方法
3.2.1 构建含单一目的基因的重组载体
3.2.2 重组载体的表达与优化
3.2.3 蛋白纯化方法
3.2.4 NMR样品的制备
3.2.5 数据的处理、分析和结构计算
3.3 实验结果与讨论
3.3.1 RsgI2-PD表达载体的表达纯化
1) RsgI2-PD-30a(86-259)的表达纯化
2) RsgI2-PD-SMT(86-259)的表达纯化
3) RsgI2-PD-30a(86-259)的稳定性实验
4) 截取不同长度的RsgI2-PD
5) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达优化
6) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达纯化
3.3.2 化学位移指认
3.3.3 RsgI2-PD-30a(89-248)的结构解析
3.4 本章小结
第四章 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究
4.1 热纤梭菌sigma的选择
4.2 实验方法
4.2.1 构建含单一目的基因的重组载体
4.2.2 重组载体的表达与优化
4.2.3 蛋白纯化方法
4.2.4 蛋白与启动子之间的EMSA实验
4.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.2.6 凝胶过滤层析技术
4.2.7 NMR滴定实验
4.3 实验结果与讨论
4.3.1 SigI2的表达纯化
4.3.2 启动子识别机制
4.3.3 sigma-anti-sigma识别机制
1) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白间的相互作用
2) 凝胶过滤层析技术检验蛋白间的相互作用
3) NMR滴定实验检验蛋白间的相互作用
4.4 本章小结
第五章 论文总结和展望
5.1 总结
5.1.1 热纤梭菌RsgI2胞内结构域的表达纯化及NMR结构分析
5.1.2 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域的表达纯化及NMR结构分析
5.1.3 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究
5.2 展望
参考文献
附录
致谢
个人简历
发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]降解纤维素的“超分子机器”研究进展[J]. 王金兰,王禄山,刘巍峰,陈冠军,高培基. 生物化学与生物物理进展. 2011(01)
本文编号：3194339
【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：85 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 纤维小体
1.1.1 脚架蛋白
1.1.2 Cohesin和dockerin模块
1.1.3 酶亚基
1.1.4 纤维小体的多样性
1.2 ECF sigma因子的研究进展
1.2.1 ECF sigma因子属于σ~(70)家族
1.2.2 ECF sigma因子的作用
1.2.3 ECF sigma因子的特点
1.2.4 ECF sigma因子的信号传导机制
1.3 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的研究进展
1.3.1 热纤梭菌中sigma-anti-sigma因子的发现
1.3.2 sigma因子的结构特点
1.3.3 anti-sigma因子的结构特点
1.3.4 anti-sigma因子对胞外多糖的特异性识别
1.3.5 anti-sigma与sigma因子的特异性相互作用
1.3.6 sigma因子和纤维小体基因表达的相关性
1.3.7 已有的anti-sigma-sigma因子的调控模型
1.4 蛋白纯化遇到的常见问题
1.4.1 蛋白的稳定性
1.4.2 蛋白的表达量
1.4.3 蛋白纯化方法的选择
1.5 蛋白结构解析的常用方法
1.6 课题研究内容与意义
第二章 热纤梭菌RsgI2胞内结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析
2.1 热纤梭菌anti-sigma因子的选择
2.2 实验材料
2.2.1 质粒与菌株
2.2.2 分子生物学相关试剂
2.2.3 主要仪器一览表(表2-1)
2.3 实验方法
2.3.1 构建含单一目的基因的重组载体
1) 目的片段的获得
2) 载体和目的基因双酶切
3) 载体和目的片段连接
4) 转化克隆菌株DH5α
5) 阳性克隆筛选与测序验证
6) 转化菌株BL21
2.3.2 重组载体的表达与优化
2.3.3 对已构建的载体进行点突变
2.3.4 蛋白纯化方法
2.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法
2.3.6 浓缩管的使用
2.3.7 NMR样品的制备
2.3.8 NMR滴定实验
2.3.9 数据的处理、分析及结构计算
2.4 实验结果矛口讨论
2.4.1 RsgI2-ND的表达纯化
1) RsgI2-ND的预表达
2) RsgI2-ND的表达纯化
3) 初步的NMR分析
4) RsgI-ND突变体的表达纯化
2.4.2 化学位移指认
2.4.3 RsgI2-ND(L23D)的结构解析
2.4.4 RsgI2-ND(L23D)与单糖、二糖的作用
2.5 本章小结
第三章 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域重组载体的克隆、表达纯化及NMR结构分析
3.1 Cthe 0267编码的anti-sigma因子存在周质空间结构域
3.2 实验方法
3.2.1 构建含单一目的基因的重组载体
3.2.2 重组载体的表达与优化
3.2.3 蛋白纯化方法
3.2.4 NMR样品的制备
3.2.5 数据的处理、分析和结构计算
3.3 实验结果与讨论
3.3.1 RsgI2-PD表达载体的表达纯化
1) RsgI2-PD-30a(86-259)的表达纯化
2) RsgI2-PD-SMT(86-259)的表达纯化
3) RsgI2-PD-30a(86-259)的稳定性实验
4) 截取不同长度的RsgI2-PD
5) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达优化
6) RsgI2-PD-30a(89-248)的表达纯化
3.3.2 化学位移指认
3.3.3 RsgI2-PD-30a(89-248)的结构解析
3.4 本章小结
第四章 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究
4.1 热纤梭菌sigma的选择
4.2 实验方法
4.2.1 构建含单一目的基因的重组载体
4.2.2 重组载体的表达与优化
4.2.3 蛋白纯化方法
4.2.4 蛋白与启动子之间的EMSA实验
4.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
4.2.6 凝胶过滤层析技术
4.2.7 NMR滴定实验
4.3 实验结果与讨论
4.3.1 SigI2的表达纯化
4.3.2 启动子识别机制
4.3.3 sigma-anti-sigma识别机制
1) 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白间的相互作用
2) 凝胶过滤层析技术检验蛋白间的相互作用
3) NMR滴定实验检验蛋白间的相互作用
4.4 本章小结
第五章 论文总结和展望
5.1 总结
5.1.1 热纤梭菌RsgI2胞内结构域的表达纯化及NMR结构分析
5.1.2 热纤梭菌RsgI2周质空间结构域的表达纯化及NMR结构分析
5.1.3 Sigma-anti-sigma因子信号传导机制的初步研究
5.2 展望
参考文献
附录
致谢
个人简历
发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]降解纤维素的“超分子机器”研究进展[J]. 王金兰,王禄山,刘巍峰,陈冠军,高培基. 生物化学与生物物理进展. 2011(01)
本文编号：3194339
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