海藻糖酶（trehalase）基因在中国卤虫滞育解除过程中的作用

发布时间：2021-06-03 20:51

　　中国卤虫（Artemia sinica）又称盐水丰年虾,是一种广温耐高盐的小型甲壳动物。其主要分布在内蒙古和青藏高原的内陆盐湖中。由于卤虫在发育过程中具有较强的抗逆能力,可以在缺氧、低温、高盐、干燥等不良环境中生存,使其作为极端生物而在生物学实验中被广泛应用。海藻糖酶的主要功能是将胞外与胞内的海藻糖水解成葡萄糖,为生物的生命活动提供能量。在体内激素的协同作用下,调控生物体内海藻糖和葡萄糖等糖类物质的浓度,从而有效的保护生物体内的细胞适应外界的不良环境。海藻糖对蛋白质、核酸等大分子具有保护作用,对生物具有对抗不良环境的抗逆保护作用。Trehalose在生物体内主要通过TPS/TPP通道合成,即尿苷二磷酸葡萄糖在海藻糖合成酶的催化作用下与6-磷酸葡萄糖产生6-磷酸海藻糖,通过海藻糖6-磷酸磷酸酯酶的催化作用生成Trehalose。海藻糖酶作为唯一能够水解海藻糖的酶,已经被证明在真菌孢子萌发,昆虫滞育结束后以及飞行时表达量增加。卤虫在滞育时产生海藻糖并储存于细胞中。当滞育结束后,在海藻糖酶的作用下将海藻糖水解成葡萄糖。但是对于其在卤虫滞育解除中的具体作用及调控机制的研究一直未见报道。因此,本... 

【文章来源】：辽宁师范大学辽宁省

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
1 前言
    1.1 卤虫的分布及生物学特征
    1.2 卤虫的滞育
    1.3 海藻糖酶（Trehalase）
    1.4 研究的目的及意义
2 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 卤虫的孵化与培养
        2.1.2 实验试剂
            2.1.2.1 总RNA的提取相关试剂（天根生化科技有限司）
            2.1.2.2 cDNA合成试剂（大连宝生物公司）
            2.1.2.3 PCR反应相关试剂（大连宝生物公司）
            2.1.2.4 核酸电泳相关试剂
            2.1.2.5 PCR产物的回收与克隆试剂
            2.1.2.6 Real-Time PCR相关试剂
            2.1.2.7 酶切及表达载体构建相关试剂
            2.1.2.8 蛋白纯化试剂
            2.1.2.9 总蛋白提取试剂
        2.1.3 仪器设备
    2.2 实验方法
        2.2.1 卤虫总RNA的获得
        2.2.2 合成cDNA
        2.2.3 Treahalase基因的扩增
        2.2.4 Trehalase 3’RACE反应
        2.2.6 PCR产物的回收与克隆
            2.2.6.1 PCR产物的回收与纯化
            2.2.6.2 载体的连接与纯化
            2.2.6.3 阳性克隆的筛选
            2.2.6.4 质粒的提取
        2.2.7 实时荧光定量PCR
        2.2.8 蛋白的原核表达
            2.2.8.1 构建PET表达载体
            2.2.8.2 小量诱导培养
            2.2.8.3 SDS-PAGE电泳
            2.2.8.4 重组蛋白表达及可溶性检测
        2.2.9 重组蛋白的大量诱导及纯化
        2.2.10 的生物信息学及生物统计学分析
3 结果
    3.1 卤虫总RNA的提取
    3.2 Treahalase基因序列的获得
    3.3 Treahalase基因全长序列
    3.4 Trehalase的生物信息学分析
    3.5 Trehalase进化树构建
    3.6 卤虫Trehalase的表达模式
        3.6.1 卤虫不同发育时期Trehalase的表达量
        3.6.2 卤虫在不同温度条件下Trehalase的表达量
        3.6.3 卤虫在不同盐度条件下Trehalase的表达量
    3.7 Trehalase ORF的扩增
    3.8 Trehalase重组蛋白的表达及纯化
        3.8.1 Trehalase重组蛋白的诱导表达
        3.8.2 Trehalase重组蛋白的可溶性检测
        3.8.3 Trehalase重组蛋白的纯化
    3.9 蛋白在卤虫不同发育时期的表达
    3.10 酶活性检测
4.讨论
    4.1 中国卤虫Trehalase基因全长及进化特征
    4.2 Trehalase不同发育时期的表达量
    4.3 Trehalase在不同温度、盐度下的表达量
    4.4 Trehalase在滞育及滞育解除中的作用
    4.5 Trehalase原核表达重组蛋白与纯化
    4.6 在不同温度下的酶活性
结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]保湿眼膜对眼周皮肤滋润作用的评价[J]. 程艳,董益阳,董美仙,王超,苏宁,孙远涛,刘娟,郑洪艳,刘玮.  临床皮肤科杂志. 2007(03)
[2]卤虫的生殖途径和影响因素[J]. 鲍鹰,逄少军.  海洋科学. 2007(02)
[3]卤虫的生物学研究[J]. 侯林,邹向阳,姚锋.  生物学通报. 2005(07)
[4]中国卤虫生物地理分布的研究[J]. 马志珍.  现代渔业信息. 1993(09)
[5]卤虫的生物学特征及鉴别休眠卵质量的简易方法[J]. 赵忠宪.  动物学杂志. 1990(03)



本文编号：3211233