嗜琼胶卵链菌比较基因组学研究及系列琼胶酶基因的克隆表达

发布时间：2017-04-23 19:12

  本文关键词：嗜琼胶卵链菌比较基因组学研究及系列琼胶酶基因的克隆表达，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：海洋碳源类型多样,碳循环途径复杂,海洋微生物参与到各个碳循环途径中,在海洋碳循环过程中起到重要作用,并针对不同碳源的降解利用进化出不同的代谢类型。新属新种嗜琼胶卵链菌YMO1T (Catenovulum agarivorans YM01T)属于γ-变形菌纲交替单胞菌科,分离自中国黄海青岛太平角海域采集表层海水样品,能够降解包括琼胶、吐温80和七叶灵在内的大分子碳水化合物,其中对琼胶的降解能力较强,能够产生高耐热性的琼胶酶。在对其基因组进行测序后发现,菌株YM01T的基因组中包含15个可能的琼胶酶基因。为了了解YM01T的碳水化合物降解能力,研究海洋微生物在海洋碳循环中所起的重要作用,我们对该菌株的基因组序列进行了进一步的分析。菌株YM01T的基因组大小为5,025,099 bp,利用Glimmer3.0软件共预测得到4,215个基因、54个tRNA。选取交替单胞菌科中5株典型的琼胶降解菌株与菌株YM01T基因组进行比对发现,6个基因组中共有860个同源基因簇,占YM01T基因总数的23.89%,与翻译、核糖体结构和生物转化(J)相关的基因在6个基因组的同源基因中所占比例最高,达到3.18%。菌株YM01T中共有892个特有基因簇,占全基因组的9.24%。其中占比例最高的是预测的一般功能性基因(R,1.22%),其次是碳水化合物的运输和代谢(G,1.15%)、信号转导机制相关基因(T,0.96%)。对6株细菌的碳水化合物利用相关基因进行进一步研究后发现,同属于嗜琼胶卵链菌属的菌株YM01T和DS2的全基因组中所含的碳水化合物利用相关基因的数目分别为447个和674个,聚类到76个糖苷水解酶家族中,占各自基因组的比例分别为10.70%和17.12%,在6个基因组中比例最高。与此同时,菌株YM01T和DS2在降解利用淀粉、纤维素、结冷胶、琼胶、果胶和木葡聚糖等大分子碳水化合物方面具有明显的基因优势。其中,YM01T中预测得到18个与琼胶降解相关的酶,包括13个β-琼胶酶、2个α-琼胶酶和3个α-新琼二糖水解酶；DS2中含有30个琼胶降解相关基因,包括17个p-琼胶酶基因,1个α-琼胶酶基因和12个α-新琼二糖水解酶。两者中琼胶降解相关基因的数目远远大于其他4个基因组,并且含有α-琼胶酶降解通路,暗示了YM01T和DS2强烈的琼胶降解能力。除此以外,菌株YM01T的基因组中包含63个趋化性相关基因,它们分别与信号识别与转导,应激性,适应性和信号转移功能相关,这暗示了菌株YM01T可以更快地对刺激做出反应,以便适应复杂多变的海洋环境。对菌株YM01T中的10个琼胶酶基因进行重组表达,获得了3个有活性的琼胶酶蛋白。其中YM01-1和YM01-5的理论分子量分别为37.8 kDa和91.6 kDa,等电点分别为4.66和5.31。对YM01-5进行纯化和酶学性质检测,发现其最适反应温度为37℃,最适反应pH为9.0,在0-37℃放置30 min能够保持80%以上的酶活力,pH 6-10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。测得的YM01-5的Km值和Vmax值分别为222.2 mg/ml,20.8U/mg。SDS、Ni2+对重组琼胶酶YM01-5有很强的抑制作用,而Mg2+和Fe3+对YM01-5的活性具有促进作用,且随着浓度升高促进作用更加明显。YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖分子,产生唯一的降解产物新琼二糖。
【关键词】：嗜琼胶卵链菌YM01~T 全基因组比较分析 碳水化合物活性酶 趋化性 琼胶酶 重组表达
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q93;Q78
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-11
• 第一章 前言11-28
• 1 微生物基因组研究进展11-16
• 1.1 微生物基因组研究概述11-12
• 1.2 细菌基因组的分析比较12-15
• 1.3 微生物全基因组的研究意义15-16
• 2 海洋微生物对碳源的降解利用16-20
• 2.1 海洋微生物降解碳源的类型16-19
• 2.2 研究微生物降解利用碳源的意义19-20
• 3 琼胶的降解利用20-26
• 3.1 琼胶酶的来源,分类20-26
• 3.2 琼胶酶的作用26
• 4 本论文的研究目的和意义26-28
• 第二章 嗜琼胶卵链菌YM01~T的比较基因组分析28-48
• 1 实验材料与仪器28-30
• 1.1 菌株28
• 1.2 试剂与培养基28-29
• 1.3 实验仪器29-30
• 2 实验方法30-31
• 2.1 基因组DNA的提取与检测30
• 2.2 菌株YM01~T全基因组测序及组装30
• 2.3 基因组组分分析及基因功能预测30
• 2.4 全基因组的比较分析30-31
• 3 实验结果与分析31-45
• 3.1 菌株YM01~T基因组DNA的提取与检测31-32
• 3.2 菌株YM01~T基因组的一般特性32-33
• 3.3 菌株YM01~T的比较基因组分析33-39
• 3.4 碳水化合物利用相关基因的分析39-44
• 3.5 趋化性基因的数量和分布44-45
• 4 讨论45-47
• 5 小结47-48
• 第三章 系列琼胶酶基因的表达、纯化及酶学性质的研究48-77
• 1 实验材料与仪器48-52
• 1.1 菌株和质粒48-51
• 1.2 试剂与培养基51
• 1.3 主要仪器51-52
• 2 实验方法52-61
• 2.1 琼胶酶基因结构分析52
• 2.2 系列琼胶酶基因的克隆表达52-56
• 2.3 重组琼胶酶的纯化56-57
• 2.4 重组琼胶酶酶学性质研究57-61
• 3 实验结果与分析61-74
• 3.1 琼胶酶基因结构分析结果61-68
• 3.2 琼胶酶基因的表达结果和酶活性检测68-69
• 3.3 重组琼胶酶的纯化及蛋白含量检测69-70
• 3.4 重组琼胶酶酶学性质研究70-74
• 4 讨论74-76
• 5 小结76-77
• 全文总结77-78
• 参考文献78-85
• 附录85-87
• 致谢87-88
• 个人简历88
• 科研成果88

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