鸭坦布苏病毒的分离、鉴定

发布时间：2017-04-25 03:15

  本文关键词：鸭坦布苏病毒的分离、鉴定，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究从西南地区的某鸭养殖场无菌采集有疑似坦布苏病毒(Tembusu virus, TMUV)症状的病鸭肝脏组织,开展了以下研究：疑似病毒的分离、鉴定；TMUV对鸭胚成纤维细胞及雏鸭的致病性试验；TMUV的全基因组序列的扩增、遗传进化分析。主要研究内容及结果如下：1.疑似病毒的分离、鉴定：采集的病料组织经剪碎、研磨、离心、过滤除菌后,接种于9日龄健康鸭胚并收集尿囊液按照常规病毒分离方法进行盲传。该病毒在鸭胚传代过程中,自盲传至3代以后,病毒液可导致鸭胚于3-4d内死亡,并致使鸭胚胚体水肿、出血,胚肝水肿、坏死。经鉴定,病毒的核酸类型为RNA,病毒为有囊膜病毒,不耐酸,对氯仿、乙醚等有机溶剂敏感,符合黄病毒成员的基本生物学特征。对收集的尿囊液经PCR或RT-PCR检测,其他几种常见鸭源病原如鸭瘟病毒(Duck plague virus, DP V)、鸭圆环病毒(Duck circovirus, DuCV)、鸭乙型肝炎病毒(Duck Hepatitis B Virus, DHBV)、鸭源禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)检测为阴性。根据TMUV-WR株NS3-NS4片段保守序列设计的特异性引物通过RT-PCR方法扩增出疑似目的条带(1250 bp),经测序、比对后发现,与已公布的黄病毒科黄病毒属恩他耶病毒IPDIA分离株核苷酸(GenBank NO:NC_018705)相似性为72.3%,与国内己公布的TMUV分离株相比,同GX2013H株(GenBank NO:KJ700462)相似性最高,为99.4%,同1q-1株(GenBank NO:KF557893)相似性最低,为96.8%。综上所述,我们初步分离得到一株源于西南地区的鸭源坦布苏病毒,将其命名为CQW1。2. TMUV-CQW1株对鸭胚成纤维细胞及雏鸭的致病性试验：以鸭胚传代至第五代病毒液为母液,接种于单层致密的鸭胚成纤维细胞孵育,培养,观察。结果发现,攻毒后24 h细胞开始出现圆缩,48 h圆缩的细胞增多,72 h细胞内空泡串联形成较大空泡,细胞脱落死亡。表明CQW1可在鸭胚成纤维细胞上进行培养增殖,并可以引起明显的细胞病变。经测定,获取的病毒液滴度为105.5 TCID50/0.05 mL。选取20只7日龄樱桃谷雏鸭进行了动物回归试验,其中10只通过颈静脉注射0.2 mL(含102.75 ELD50)病毒液作为攻毒组,10只通过注射等量PBS溶液分笼饲养作为阴性对照组。结果发现,雏鸭攻毒后出现明显的食欲下降、不愿走动,精神萎靡、共济失调,死亡时呈角弓反张等神经症状。攻毒组共10只发病,发病率为100%,6只于攻毒后自然死亡,死亡率为60%；对照组无明显临床症状。动物回归试验结果表明,CQW1株能够引起雏鸭死亡,死亡率可达60%。 RT-PCR结果发现,能够从病鸭的血液、肝脏、大脑组织中检测到TMUV。病理学观察结果表明,CQW1株可导致脑膜血管充血、脱落,同时引起大脑组织神经胶质细胞增生,大量神经胶质细胞趋向坏死的神经元细胞,形成明显的“噬神经元现象”。另外可导致病鸭肝脏出血、淤血,大量肝细胞变性、坏死,肝小叶结构紊乱,同时存在有较多新生肝细胞。3. TMUV-CQW1株的全基因组序列的扩增及遗传进化分析：通过设计相互覆盖TMUV cDNA全长的引物,分段扩增、测序、拼接获得了CQW1株全长基因组序列(GenBank NO. KM233707)。全基因组序列分析结果表明,CQW1株全长10992 nt,含有一个开放阅读框(ORF),编码一个长为2625 aa的多聚蛋白,预测的多聚蛋白切割位点与其他TMUV成员一致,共编码10个功能蛋白。黄病毒代表成员以及坦布苏病毒分离株的进化树分析表明,CQW1株属于黄病毒属恩他耶家族成员,CQW1与其他TMUV成员在全基因组核苷酸和氨基酸相似性分别为96.8%-99.1%,98.4%-99.6%,与广西株GX2013H亲缘关系最近,两者够成了一个独立的进化分枝。与国内其他分离株相比,CQW1同其他分离株的平均进化距离(0.0299)高于其他毒株之间的平均进化距离(0.0163),表明CQW1株同其他分离株相比,有一定的地域差异。选取34条TMUVE基因按照不同年份分组进行分子变异分析,结果表明,TMUV的E基因遗传多样性随时间变化明显,且在2010-2013年之间以平均3.8×10-3/年的速率多样化,多样化速率相对其他黄病毒成员较快。另外,各年份之间以2010年遗传分化率最低,2011-2012相对平稳,而2013年的遗传分化率最高,显示出了该病毒在2010-2013年的遗传分化特征。
【关键词】：鸭坦布苏病毒 西南地区 分离鉴定 进化分析
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-11
• 第一部分 文献综述及选题背景11-16
• 第一章 坦布苏病毒研究进展11-16
• 1 坦布苏病毒病原分类地位11
• 2 TMUV的生物学特征11-13
• 3 TMUV的致病性13-14
• 4 TMUV的流行病学特征14-15
• 5 本研究的选题背景15-16
• 第二部分 试验研究16-47
• 第二章 鸭坦布苏病毒的分离鉴定16-36
• 1 实验材料16-19
• 1.1 病料来源16
• 1.2 实验动物16
• 1.3 分子生物学试剂16-17
• 1.4 主要试剂及配制17-18
• 1.5 主要仪器18-19
• 2 实验方法19-25
• 2.1 病毒的分离及传鸭胚代19-20
• 2.1.1 组织采集及处理19
• 2.1.2 病原体的鸭胚分离及传代19-20
• 2.2 病原的RT-PCR或PCR检测20-22
• 2.2.1 病原总RNA提取20
• 2.2.2 cDNA的合成20
• 2.2.3 病原总DNA的提取20-21
• 2.2.4 PCR及RT-PCR检测21-22
• 2.3 病毒理化性质鉴定22
• 2.3.1 病毒核酸类型鉴定22
• 2.3.2 脂溶剂敏感性试验22
• 2.3.3 耐酸性试验22
• 2.3.4 胰蛋白酶敏感性试验22
• 2.4 病毒的DEF细胞培养特性22-23
• 2.5 病毒毒力测定23-24
• 2.5.1 TCID_(50)的测定23
• 2.5.2 ELD_(50)的测定23-24
• 2.6 动物回归试验24
• 2.7 病理组织切片观察24-25
• 2.7.1 玻片和盖玻片的处理24
• 2.7.2 病理组织切片制作24-25
• 3 试验结果25-33
• 3.1 病毒的传代分离结果25-26
• 3.2 病原RT-PCR检测结果26-27
• 3.3 病毒理化性质鉴定27-28
• 3.3.1 核酸类型鉴定结果27
• 3.3.2 脂溶剂敏感性试验结果27
• 3.3.3 耐酸性试验结果27-28
• 3.3.4 胰蛋白酶敏感性试验结果28
• 3.4 CQW1的DEF细胞培养特性28-29
• 3.5 病毒毒力测定29-30
• 3.5.1 TCID_(50)的测定29
• 3.5.2 ELD_(50)的测定29-30
• 3.6 动物回归试验30-32
• 3.7 病理组织切片观察32-33
• 4 讨论与分析33-35
• 5 本章小结35-36
• 第三章 TMUV西南株CQW1全基因组序列测定及遗传进化分析36-47
• 1 试验材料36
• 1.1 毒株及其序列来源36
• 1.2 主要仪器设备36
• 1.3 操作系统及分析软件36
• 1.4 主要分子生物学试剂耗材36
• 2 试验方法36-40
• 2.1 引物设计36-37
• 2.2 全基因组序列测定37-38
• 2.2.1 总RNA的抽提37
• 2.2.2 全基因组的RT-PCR扩增37
• 2.2.3 基因组序列的拼接37-38
• 2.3 基因组结构特征分析38
• 2.4 系统进化分析38-40
• 2.4.1 全基因组序列分析38-40
• 2.4.2 E基因序列遗传变异分析40
• 3 实验结果40-45
• 3.1 引物设计40-41
• 3.2 全基因组序列测定41
• 3.3 基因组结构特征分析41-42
• 3.4 系统进化分析42-45
• 3.4.1 全基因组序列分析42-44
• 3.4.2 E基因序列遗传变异分析44-45
• 4 讨论与分析45-46
• 5 本章小结46-47
• 参考文献47-55
• 致谢55-56
• 附录：CQW1株全基因组序列56-60
• 个人简历及发表的学术论文目录60

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