鸡传染性支气管炎病毒IgY抗体基因的扩增及表达

发布时间：2017-04-25 04:04

  本文关键词：鸡传染性支气管炎病毒IgY抗体基因的扩增及表达，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究旨在利用基因工程抗体技术制备鸡传染性支气管炎IgY抗体,为鸡抗体基因的研究和特异性抗体的制备提供相关数据,同时也为鸡传染性支气管炎的治疗及诊断提供帮助。为了扩增鸡IgY抗体基因全长序列,本试验首先提取鸡脾脏总RNA,然后反转录成cDNA,按照NCBI上公布的鸡轻链抗体基因序列合成特异引物,利用PCR技术扩增出轻链ORF序列。由于网上没有公布出鸡IgY抗体基因的重链全长序列,因此我们根据已公布出的重链恒定区序列设计引物分别利用5'RACE和3'RACE万法扩增后测序验证,将验证正确的两段序列通过DNAStar软件拼接后找到ORF序列,再次设计引物利用重叠PCR方法扩增出重链ORF序列。将轻、重链扩增出的目的条带分别连接到克隆载体上,经转化感受态细胞DH5a后,选取单菌落摇菌抽取质粒,经酶切和PCR双重验证正确的质粒送往公司测序。序列结果显示扩增出的轻链ORF序列长705bp,编码234个氨基酸与已公布的序列同源性达到95%；重链ORF序列长1716bp,编码571个氨基酸,其可变区基因序列符合鸡抗体重链可变区基因特征,其恒定区序列与已公布的鸡IgY抗体基因重链序列同源性达到99%。说明我们己成功构建扩增鸡IgY抗体基因轻、重链序列的方法。为了表达鸡IBV特异性抗体基因序列,首先将30只1日龄雏鸡随机分成2组,分别饲养在隔离的动物房中。待母源抗体水平下降后,第一组用弱毒疫苗株4/91进行免疫,14天后进行2免,第二组作为空白组不做处理。一免后每隔7天采集两组血样分离血清,间接ELISA法检测特异性抗体,待抗体水平明显升高时采集两组鸡脾脏,提取总RNA,扩增抗体基因。发现轻链可变区之间的变异非常大,而重链变异较小。从免疫鸡中挑选出一条抗体基因将其定向克隆入表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达载体pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-L。将测序正确的两种重组载体共转染293T细胞,然后利用间接免疫荧光、RT-PCR、间接ELISA等检测方法对目的蛋白的表达及其特异性进行检测。间接免疫荧光结果显示在分别转染和共转染的细胞中均可见绿色荧光,而转染空质粒和未转染的细胞中未检测到绿色荧光RT-PCR检测,在共转染pcDNA3.1-H和pcDNA3.1-L的细胞中扩增出目的基因,而转染空载体的细胞中未得到相应的目的产物；间接ELISA结果显示共转染重组质粒的细胞上清能与IBV的鸡胚尿囊液发生特异性结合,与NDV、H5、H9和阴性尿囊液均无特异性反应；而转染空质粒和未转染的细胞上清均无特异性反应。说明我们成功表达出针对IBV特异性的抗体。综上所诉,本试验成功构建一种快速扩增鸡IgY抗体基因的方法,并利用该方法对扩增出的大量抗体基因进行分析研究,为鸡源性抗体库的构建及特异性抗体基因的筛选提供指导；从免疫鸡IBV弱毒疫苗株的鸡脾脏中扩增出全长抗体基因,通过将其定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1中,构建了带有组氨酸标签的鸡IgY抗体基因重链和轻链表达质粒,并成功实现了在293T细胞中的表达,这对利用基因工程抗体技术获得完整的特异性抗体分子的研究打下了基础,为后续大量生产IBV特异性单抗,克服传统方法生产单抗费时费力及抗体中含有鼠源成分等缺点提供新思路。
【关键词】：IBV IgY 克隆 真核表达
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 英文缩略词对照表8-14
• 第一部分 文献综述和选题目的以及意义14-26
• 1 鸡传染性支气管炎概述14-17
• 1.1 IBV病毒特征14-15
• 1.2 鸡传染性支气管炎的危害15-16
• 1.3 鸡传染性支气管炎的防治16-17
• 2 基因工程抗体研究进展17-22
• 2.1 基因工程抗体简介17-18
• 2.2 基因工程抗体表达系统介绍18-20
• 2.2.1 大肠杆菌表达系统18-19
• 2.2.2 酵母表达系统19
• 2.2.3 昆虫细胞表达系统19-20
• 2.2.4 植物表达系统20
• 2.2.5 哺乳类细胞表达系统20
• 2.3 基因工程抗体在鸡抗体基因方面的相关研究20-22
• 3 RACE技术研究进展22-25
• 3.1 RACE的原理和方法22-23
• 3.2 几种改进的RACE技术23-25
• 3.3 RACE成功的关键环节25
• 4 研究目的及意义25-26
• 第二部分 实验内容26-58
• 第一章 鸡IGY抗体基因的扩增26-42
• 1 实验材料26-27
• 1.1 实验动物26
• 1.2 主要生物试剂26
• 1.3 主要实验器材26-27
• 1.4 常用试剂的配制27
• 2 实验方法27-37
• 2.1 样品的制备27-28
• 2.2 总RNA的提取28-29
• 2.3 鸡抗体基因重链IgY全长序列的获得29-35
• 2.3.1 重链基因5'端序列的获得(5'RACE)29-32
• 2.3.2 重链IgY基因3'端序列的获得(3'RACE)32-33
• 2.3.3 重链IgY全长序列的拼接33-35
• 2.4 鸡抗体基因轻链全长序列的扩增及分析35-37
• 2.4.1 引物设计35
• 2.4.2 反转录35-36
• 2.4.3 PCR扩增36
• 2.4.4 序列测定及分析36-37
• 3 实验结果37-41
• 3.1 鸡IgY重链5'RACE、3'RACE及全长序列扩增结果37
• 3.2 鸡IgY重链基因序列分析37-39
• 3.2.1 5'RACE序列分析37-39
• 3.2.2 3'RACE序列分析39
• 3.2.3 重链全长序列分析39
• 3.3 鸡轻链全长序列扩增结果39-40
• 3.4 鸡轻链IgL基因序列分析40-41
• 4 讨论41-42
• 第二章 抗鸡IBV特异性IGY抗体真核表达载体的构建及表达检测42-58
• 1 材料与方法42-45
• 1.1 实验动物及鸡胚42
• 1.2 质粒、疫苗株和细胞42-43
• 1.3 主要生物试剂43
• 1.4 主要实验器材43
• 1.5 常用试剂的配制43-45
• 2 实验方法45-51
• 2.1 鸡胚接种45
• 2.2 EID50测定45
• 2.3 动物实验45-46
• 2.4 抗体基因的扩增及测序46-47
• 2.4.1 引物设计46
• 2.4.2 PCR扩增46
• 2.4.3 测序分析46-47
• 2.5 重组真核表达载体的构建47-48
• 2.5.1 重组质粒和载体的双酶切47
• 2.5.2 目的片段与pcDNA3.1(+)载体的连接转化47-48
• 2.5.3 无内毒素质粒的提取及鉴定48
• 2.5.4 质粒DNA的浓度测定48
• 2.6 重组真核质粒的表达48-50
• 2.6.1 293T细胞的复苏48-49
• 2.6.2 293T细胞的传代培养49
• 2.6.3 细胞转染49-50
• 2.7 重组真核质粒的表达鉴定50-51
• 2.7.1 间接免疫荧光检测蛋白的表达50
• 2.7.2 RT-PCR检测50
• 2.7.3 间接ELISA检测50-51
• 3 实验结果51-56
• 3.1 EID50测定结果51
• 3.2 动物实验结果51-52
• 3.3 序列扩增结果52
• 3.4 序列分析结果52-53
• 3.5 重组载体双酶切和测序结果53-54
• 3.6 表达蛋白检测结果54-56
• 3.6.1 间接免疫荧光染色鉴定鸡抗体基因的表达54-55
• 3.6.2 RT-PCR检测结果55-56
• 3.6.3 间接ELISA检测结果56
• 4 讨论56-58
• 结论58-59
• 参考文献59-66
• 致谢66

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