微生物脂肪酶库构建及磷脂酶D的筛选与应用

发布时间：2017-04-26 16:04

  本文关键词：微生物脂肪酶库构建及磷脂酶D的筛选与应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脂肪酶作为工业大宗酶之一,能够催化水解、酯合、酯交换、醇解、酸解、氨解等反应,被广泛地用于食品、医药、纺织、饲料、洗涤、造纸、生物柴油及环境保护等领域。微生物脂肪酶相比于动植物来源脂肪酶具有来源广泛、易于制备、底物特异性较强、催化效率较高、反应条件温和、副产物较少等优点。伴随着脂肪酶应用范围的扩大,对其特异性的要求也逐渐提高,从自然界中筛选特异性脂肪酶菌株是一个较为简便可行的方法。利用维多利亚蓝和皂化钙圈的方法我们从19份内陆土壤样品和22份南海深海沉积物样品中平板初筛获得538株产酶菌株。复筛我们采用特异性酶活测定方法,脂肪酶水解活力采用p-NP法,磷脂酶D水解酶活力采用酶联比色法,酯合活力采用棕榈酸乙酯法,转酯活力采用DHA甘油酯法。复筛结果显示538株初筛菌株中具有脂肪酶水解活力的菌株有295株；具有PLD水解活力菌株有293株；具有酯合成活力的菌株有138株：具有酯交换活力的菌株有23株。具有较高水解活力的菌株有57株：较高PLD水解活力的菌株有55株：较高酯合活力的菌株有3株。其中水解酶和PLD酶的相关度为45.08%,水解酶和酯合酶的相关度为27.5%,酯合酶和酯交换酶的相关度为82.1%。我们对部分南海特异性菌株进行了16S rDNA鉴定分析,发现变形杆菌门占绝对优势,其中嗜冷菌、芽孢杆菌、交替假单胞菌为优势菌属。脂肪酶库中538号菌株经过16S rDNA鉴定为麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia),通过硫酸铵沉淀、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层析获得电泳纯蛋白条带。蛋白质测序发现其属于Ⅰ型磷脂酶含有GxSxG保守序列,相对分子质量为41.8 KD,等电点为8.86。酶学性质研究发现该酶最适的催化温度为40℃,最适pH为7-8,在10-40℃内能够保持酶活的稳定性,在pH 5-12的范围内能够维持80%以上活力,金属离子Fe3+和化学试剂SDS能够抑制90%以上的酶活。磷脂酶D(Phospholipid D,EC 3,1.4.4,缩写PLD)能够催化水解磷脂分子中4位酯键,生成磷脂酸和有机碱：同时,还能通过碱基交换反应催化各种羟基化合物与磷脂碱基结合形成新的磷脂。目前报道的大部分PLD的水解活性远高于转碱基活性,这限制了其在制备单一磷脂和稀有磷脂等磷脂改性过程的应用。本研究以脂肪酶库中具有PLD水解活力菌株及大豆磷脂残渣为样品筛选具有碱基交换活性的PLD菌株,并将其用于磷脂酰丝氨酸合成。通过大量的筛选我们共获得了6株具有磷脂酰丝氨酸合成能力菌株,分别对其进行了16S rDNA鉴定。其中a2菌株经过鉴定为抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens),其在双相体系中50℃反应12h磷脂酰丝氨酸的转化率为47.8%,选择率为74%,具有很好的应用前景。利用H103大孔树脂对Acinetobacter radioresistens a2的PLD进行纯化。步纯化获得了电泳纯PLD蛋白,其相对分子量在40 KD左右。
【关键词】：脂肪酶 嗜麦芽寡养单胞菌 磷脂酶D 抗辐射不动杆菌 磷脂酰丝氨酸
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q936
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 0 前言14-37
• 0.1 脂肪酶14-24
• 0.1.1 脂肪酶简介14-17
• 0.1.2 脂肪酶特性17-20
• 0.1.3 脂肪酶的应用20-24
• 0.2 磷脂改性与磷脂酶D24-35
• 0.2.1 磷脂简介24-25
• 0.2.2 磷脂酰丝氨酸简介25-26
• 0.2.3 磷脂改性的方法26-30
• 0.2.4 磷脂酶D简介30-31
• 0.2.5 磷脂酶D的催化特性31-35
• 0.3 研究意义和主要研究内容35-37
• 0.3.1 研究意义35-36
• 0.3.2 研究内容36-37
• 1 微生物脂肪酶库构建及南海产脂肪酶微生物多样性分析37-64
• 1.1 引言37-38
• 1.2 材料与方法38-50
• 1.2.1 样品信息38-40
• 1.2.2 仪器与试剂40-41
• 1.2.3 培养基配方41-42
• 1.2.4 产脂肪酶微生物筛选42-49
• 1.2.5 细菌16S rDNA鉴定49-50
• 1.3 结果与讨论50-62
• 1.3.1 产酶微生物酶活多样性分析50-51
• 1.3.2 南海产脂肪酶微生物多样性分析51-62
• 1.4 本章小结62-64
• 2 嗜麦芽寡养单胞菌LH15脂肪酶的纯化及酶学性质研究64-76
• 2.1 引言64
• 2.2 材料与方法64-68
• 2.2.1 仪器与试剂64
• 2.2.2 菌株64
• 2.2.3 培养基配方64-65
• 2.2.4 酶活测定方法65
• 2.2.5 蛋白质测定方法65
• 2.2.6 LH15生长曲线测定65
• 2.2.7 LH15纯化65-66
• 2.2.8 SDS-PAGE检测66-67
• 2.2.9 LH15酶学性质67-68
• 2.2.10 蛋白测序68
• 2.3 结果与讨论68-75
• 2.3.1 LH15的生长曲线68-69
• 2.3.2 LH15进化分析69
• 2.3.3 LH15脂肪酶的纯化69-70
• 2.3.4 SDS-PAGE检测70-71
• 2.3.5 LH15脂肪酶的酶学性质71-73
• 2.3.6 蛋白测序73-75
• 2.4 本章小结75-76
• 3 具有转碱基活性的磷脂酶D菌株筛选76-85
• 3.1 引言76
• 3.2 材料与方法76-79
• 3.2.1 样品信息76-77
• 3.2.2 仪器与材料77
• 3.2.3 培养基配方77
• 3.2.4 具有转碱基活性的PLD菌株筛选77-78
• 3.2.5 双水相磷脂酰丝氨酸合成78
• 3.2.6 磷脂酰丝氨酸检测78-79
• 3.2.7 细菌鉴定及进化分析79
• 3.3 结果与讨论79-83
• 3.3.1 脂肪酶库筛选结果79-80
• 3.3.2 大豆磷脂残渣中筛选80-81
• 3.3.3 具有转碱基活性菌株16S rDNA鉴定81-82
• 3.3.4 具有转碱基活性菌株进化分析82-83
• 3.4 本章小结83-85
• 4 抗辐射不动杆菌a2催化合成磷脂酰丝氨酸及其发酵纯化85-90
• 4.1 引言85
• 4.2 材料与方法85-87
• 4.2.1 仪器与试剂85
• 4.2.2 材料85-86
• 4.2.3 a2催化合成磷脂酰丝氨酸86
• 4.2.4 磷脂酰丝氨酸检测86
• 4.2.5 a2 PLD纯化86
• 4.2.6 磷脂酶D水解活力测定86
• 4.2.7 蛋白质含量测定86-87
• 4.2.8 SDS-PAGE电泳87
• 4.3 结果与讨论87-89
• 4.3.1 a2 PLD催化合成PS87-88
• 4.3.2 a2 PLD纯化88-89
• 4.4 本章小结89-90
• 5 总结与展望90-95
• 5.1 引言90-91
• 5.2 总结91-92
• 5.3 本论文的不足92-93
• 5.4 展望93-95
• 参考文献95-102
• 致谢102-103
• 个人简历103

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