利用分析Fto功能及运用单碱基编辑技术研究m 6 A去甲基化的作用

发布时间：2021-07-30 02:52

　　N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m⁶A）是真核生物mRNA中最丰富的一种甲基化修饰。甲基转移酶和去甲基化酶的存在,使得m⁶A修饰在细胞中成为一个动态可逆的过程,最终决定m⁶A修饰的靶mRNA转录本的命运。m⁶A在基因表达调节、蛋白质翻译、细胞行为等方面起着至关重要的作用。肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity associated protein,Fto）是一种m⁶A去甲基化酶,其在脑发育中的m⁶A去甲基化的生物学功能仍未知。因此本研究构建了Fto基因敲除鼠（Fto-KO）,基于分析m⁶A去甲基化酶Fto的功能来探索m⁶A去甲基化在小鼠脑发育中的生物学作用。结果显示,在小鼠出生后第14天（P14）,与野生型小鼠相比,Fto-KO鼠的体重、体长和脑组织重量均显著性下调。其次,P14时期Fto-KO小鼠的全脑组织明显变小,特别是小脑发生严重畸形。此外,小鼠脑组织冷冻切片尼氏染色结... 

【文章来源】：华侨大学福建省

【文章页数】：86 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

CRISPR/Ca9系统的作用机制CRISPR/Ca9系统切割DNA链，产生双链DNA缺口后

22图2.1Fto基因敲除策略首先设计合适的sgRNA靶向Fto基因的3号外显子，然后将Cas9mRNA和sgRNA显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，通过非同源重组修复方式（NHEJ）造成Fto基因蛋白读码框移码，功能缺失。2、小鼠交配策略本研究是基于分析m6A去甲基化酶Fto的功能来研究m6A去甲基化对小鼠脑发育的影响，所以需要获得一定数量的Fto纯合子基因敲除鼠（基因型标记为-/-）供后续试验研究。小鼠交配策略如图2.2所示。首先，将获得的F0代Fto杂合子基因敲除鼠（基因型标记为+/-）和野生型C57BL/6J小鼠（基因型标记为+/+）交配，繁殖获得一定数量的Fto杂合子基因敲除鼠。然后将获得的Fto杂合子基因敲除鼠雌雄同笼进行繁殖，获得目的Fto纯合子基因敲除鼠进行后续实验。同时，也获得了更多的Fto杂合子基因敲除鼠，这一部分小鼠继续雌雄同笼进行繁殖以获得更多的Fto纯合子基因敲除鼠。

23图2.2Fto基因敲除鼠初步交配策略图中白色背景的为野生型小鼠（+/+），绿色背景的为Fto杂合子基因敲除鼠（+/-），红色背景的为Fto纯合子基因敲除鼠（-/-）。2.1.2.2小鼠基因组DNA的抽提1、用酒精棉擦拭剪刀，然后剪取约3mm小鼠的尾尖放置于无菌的2mL离心管中。2、向上述离心管中加入600μL细胞裂解缓冲液（BufferSalting-out）和6μL蛋白酶K（10mg/mL），上下颠倒混匀后放置于55℃恒温箱内过夜消化。3、加入600μL的DNA提取液（苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），充分颠倒混匀后12000rpm，离心10min。4、用200μL的移液枪缓慢地吸取适量的上清液并转移至无菌的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇。充分颠倒混匀后，放置于离心机中，12000rpm离心15min。5、离心完毕后，弃去上清液，并将离心管放置在通风橱内使沉淀充分干燥。然后根据沉淀的大小加入50μL至200μL无菌水，充分溶解即可得到DNA溶液，然后将其放置于-20℃保存。


本文编号：3310539