狼蛛毒素LCTX-F2的表达与活性研究
发布时间：2021-08-12 19:36
狼蛛在世界各地分布广泛,隶属节肢动物门、螯肢亚门、蛛形纲、蜘蛛目,在蜘蛛目中按物种多样性来划分位居第四,其毒液中含有丰富的多肽毒素待开展研究。近年来凝血酶Thrombin是开发促凝与抗凝血药物的重要靶点,ASIC3通道是治疗细胞外酸化所致疼痛的重要靶点,Thrombin和ASIC3的调制剂筛选仍是当前研究的热点与方向。在前期研究中,已从格氏狼蛛毒液中鉴定出一种新的具有促凝血因子活性及酸敏感离子通道抑制剂多肽毒素LCTX-F2。在凝血因子方面,可以促进凝血因子FXa、FXIIa、Thrombin和Kallikrein的酶活力,加快血液的凝固。另外在酸敏感通道方面,LCTX-F2可逆性抑制ASIC1a和ASIC3通道电流,其IC50分别为5.8μM和4.6μM。但LCTX-F2促进凝血因子活性和抑制酸通道活性的关键位点尚不清楚。多肽毒素LCTX-F2包含65个氨基酸残基,由4对二硫键组成,其相对分子质量为7452 Da,是一个经典的抑制剂半胱氨酸结（ICK）结构模体。NCBI-BLAST序列比对中,LCTX-F2与穴居狼蛛（Lycosa singoriensis）转录...
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Thrombin与抑制剂avathrin复合物的晶体结构及相互作用的活性部位（
狼蛛毒素LCTX-F2的表达与活性研究19（MALDI-TOF-MS）测定。（3）大量富集鉴定正确的目的峰，进行冻干，获得原核表达样品。2.3实验结果与分析2.3.1LCTX-F2的序列分析及突变体设计蜘蛛毒液中包含多种组分，其中以富含神经毒素的多肽和蛋白质为主要成分。本课题组从格式狼蛛中分离到的活性成分LCTX-F2，是由65个氨基酸组成的促凝血因子活性和ASIC3通道的多肽毒素抑制剂。通过NCBI-BLAST序列比对（图2-1），LCTX-F2与穴居狼蛛（Lycosasingoriensis）转录组中的多个序列具有高同源性96%，但这些序列的功能是未知的。LCTX-F2与来自狼蛛Alopecosamarikovskyi毒液中的PT2具有81.2%的同源性，PT2是一个已知P2X3受体抑制剂，但LCTX-F2不具备抑制P2X3受体的活性。在前期研究中，针对多肽毒素LCTX-F2只研究了对凝血因子和ASIC通道抑制活性的影响，其多肽毒素的活性部位及相互作用机制尚未阐明，因此本研究构建不同的LCTX-F2突变体，研究多肽促进凝血因子活性和抑制酸通道活性的关键位点。在LCTX-F2突变体的设计上，跟从序列比对上的氨基酸差异（如7号位的精氨酸，26号位的天冬氨酸，仅在PT2毒素中出现），自身多肽一些带正负电荷的氨基酸及分子对接模拟手段，一共设计了16个突变体（K2E、R7E、R15E、R20E、D10A、D10R、D14A、D14R、D26A、D26R、F31A、V41A、G35A、S43A、E54A和K61A），如图2-2所示。图2-1多肽毒素LCTX-F2的序列比对。注：序列分析表明F2由一个经典的43氨基酸组成的ICK模型加一个22氨基酸组成的线性C末端，整个序列包含8个半胱氨酸。图中灰色代表相同氨基酸，黑色代表半胱氨酸以及配对模式。
硕士学位论文20图2-2多肽毒素LCTX-F2与突变体氨基酸序列。根据LCTX-F2构建的16条突变体氨基酸序列，全长由65个氨基酸组成，红色标记为该为点突变的氨基酸，相应突变体的分子质量标记在右侧。2.3.2LCTX-F2突变体的构建利用PrimerPremier5软件对相应突变体进行引物设计，按照以设计好的PCR反应体系及扩增条件，在原始的LCTX-F2载体模板上进行定点突变。扩增完的质粒用感受态细胞DH5α转化挑取若干单克隆，测序结果通过DNAMAN软件比对，如图2-3所示，设计的突变氨基酸位点成功被替换成了相应的碱基序列，初步成功构建了16个突变载体，可用于后续的原核表达。
【参考文献】：
期刊论文
[1]古老的进化物种 奇异的蜘蛛世界[J]. 胡喜海. 中学生物学. 2007(03)
博士论文
[1]作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究[D]. 张凡.湖南师范大学 2015
[2]民族药飞龙掌血止血活性成分与质量控制方法研究[D]. 刘志刚.沈阳药科大学 2012
硕士论文
[1]直接Xa因子抑制剂TY1703抗血栓作用及机制研究[D]. 邱小妙.天津医科大学 2019
[2]基于狼蛛转录组筛选的一种多肽毒素结构和功能研究[D]. 苏格.湖南师范大学 2018
本文编号：3338942
【文章来源】：湖南师范大学湖南省 211工程院校
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
Thrombin与抑制剂avathrin复合物的晶体结构及相互作用的活性部位（
狼蛛毒素LCTX-F2的表达与活性研究19（MALDI-TOF-MS）测定。（3）大量富集鉴定正确的目的峰，进行冻干，获得原核表达样品。2.3实验结果与分析2.3.1LCTX-F2的序列分析及突变体设计蜘蛛毒液中包含多种组分，其中以富含神经毒素的多肽和蛋白质为主要成分。本课题组从格式狼蛛中分离到的活性成分LCTX-F2，是由65个氨基酸组成的促凝血因子活性和ASIC3通道的多肽毒素抑制剂。通过NCBI-BLAST序列比对（图2-1），LCTX-F2与穴居狼蛛（Lycosasingoriensis）转录组中的多个序列具有高同源性96%，但这些序列的功能是未知的。LCTX-F2与来自狼蛛Alopecosamarikovskyi毒液中的PT2具有81.2%的同源性，PT2是一个已知P2X3受体抑制剂，但LCTX-F2不具备抑制P2X3受体的活性。在前期研究中，针对多肽毒素LCTX-F2只研究了对凝血因子和ASIC通道抑制活性的影响，其多肽毒素的活性部位及相互作用机制尚未阐明，因此本研究构建不同的LCTX-F2突变体，研究多肽促进凝血因子活性和抑制酸通道活性的关键位点。在LCTX-F2突变体的设计上，跟从序列比对上的氨基酸差异（如7号位的精氨酸，26号位的天冬氨酸，仅在PT2毒素中出现），自身多肽一些带正负电荷的氨基酸及分子对接模拟手段，一共设计了16个突变体（K2E、R7E、R15E、R20E、D10A、D10R、D14A、D14R、D26A、D26R、F31A、V41A、G35A、S43A、E54A和K61A），如图2-2所示。图2-1多肽毒素LCTX-F2的序列比对。注：序列分析表明F2由一个经典的43氨基酸组成的ICK模型加一个22氨基酸组成的线性C末端，整个序列包含8个半胱氨酸。图中灰色代表相同氨基酸，黑色代表半胱氨酸以及配对模式。
硕士学位论文20图2-2多肽毒素LCTX-F2与突变体氨基酸序列。根据LCTX-F2构建的16条突变体氨基酸序列，全长由65个氨基酸组成，红色标记为该为点突变的氨基酸，相应突变体的分子质量标记在右侧。2.3.2LCTX-F2突变体的构建利用PrimerPremier5软件对相应突变体进行引物设计，按照以设计好的PCR反应体系及扩增条件，在原始的LCTX-F2载体模板上进行定点突变。扩增完的质粒用感受态细胞DH5α转化挑取若干单克隆，测序结果通过DNAMAN软件比对，如图2-3所示，设计的突变氨基酸位点成功被替换成了相应的碱基序列，初步成功构建了16个突变载体，可用于后续的原核表达。
【参考文献】：
期刊论文
[1]古老的进化物种 奇异的蜘蛛世界[J]. 胡喜海. 中学生物学. 2007(03)
博士论文
[1]作用于疼痛相关钠通道的多肽毒素的结构与功能研究[D]. 张凡.湖南师范大学 2015
[2]民族药飞龙掌血止血活性成分与质量控制方法研究[D]. 刘志刚.沈阳药科大学 2012
硕士论文
[1]直接Xa因子抑制剂TY1703抗血栓作用及机制研究[D]. 邱小妙.天津医科大学 2019
[2]基于狼蛛转录组筛选的一种多肽毒素结构和功能研究[D]. 苏格.湖南师范大学 2018
本文编号：3338942
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/benkebiyelunwen/3338942.html
