青岛文昌鱼（Branchiostoma japonicum）viperin表达和功能特性

发布时间：2017-05-02 22:17

  本文关键词：青岛文昌鱼（Branchiostoma japonicum）viperin表达和功能特性，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Viperin是一种已被熟知的抗病毒蛋白,它会被类型Ⅰ、类型Ⅱ和类型Ⅲ干扰素,一些DNA和RNA病毒,LPS,poly(I:C)强烈诱导。Viperin包含3个功能域,分别为具有两亲性α螺旋结构的多变N-端,包含有Cx3Cx2C结构的中间区域和非常保守的C-端。其中N-端对于viperin的亚细胞定位非常重要,中间区域的Cx3Cx2C结构为radical-SAM酶的特有结构,可以参与[4Fe-4S]簇的形成,介导一系列的氧化还原反应,而保守的C-端最近已经被证实对于抗病毒功能是至关重要。现已知,viperin存在于从鱼类到哺乳动物的一些物种中,而在文昌鱼中viperin的相关信息还未有报道。在本实验中,我们通过PCR,RACE技术克隆得到一条可能是青岛文昌鱼viperin的基因,它的长度为1540bp,其中开放阅读框(ORF)部分为1074bp,5’非翻译区为71bp,而3’非翻译区为395bp。通过该基因与人,黑猩猩,小鼠等12个物种进行序列比对发现在青岛文昌鱼中该基因与其他物种的viperin基因相似度为60.7%-87.8%,且该基因的N-端同样多变,而中间区域和C-端则非常保守。而后对该基因的结构分析我们发现,该基因与其他物种的viperin基因一样,同样包含四个保守的模序,其中模序1含有Cx3Cx2C结构。蛋白质的二级结构预测表明该基因编码的蛋白含有Elp3结构域,属于MoaA超家族,有radical-SAM酶的活性。三级结构预测则表明该基因编码的蛋白与其他物种中的viperin蛋白有非常相似的三级结构。这些都表明我们所获得的基因正是viperin基因,因此我们将它命名为Bjvip。之后我们对viperin基因在3种文昌鱼和24种鱼的进化选择压力分析表明,在位点模型中,viperin基因在进化中存在正向选择的位点,且这些位点都位于N-端。而在支-特异模型中,二比率模型并未筛选出受到正向选择压力的支系。共线性分析表明在所分析的除鸭嘴兽外的脊索动物中,viperin (RSAD2)总会与CMPK2连接在一起,这表明CMPK2-RSAD2的连接在脊索动物的进化中是高度保守的。通过对viperin基因在青岛文昌鱼中的表达模式分析我们发现Bjvip主要在肝盲囊,肌肉,鳃,后肠中表达,而在卵巢,脊索,精巢中少量表达。这表明viperin在青岛文昌鱼中的表达有组织特异性。而通过poly (I:C)刺激青岛文昌鱼后我们发现,Bjvip在所有检测的组织(肝盲囊,肌肉,鳃,后肠)中表达量均明显升高,表明poly(I:C)的刺激可以诱导Bjvip的表达。为了进一步验证BjVip蛋白是否也同样具有抗病毒功能,在体外实验中,通过构建真核表达载体并转染入FG细胞后,用LCDV病毒感染细胞,并通过qRT-PCR检测细胞内病毒的相对数量,结果显示,在病毒感染48h和72h时,转染目的蛋白组病毒相对数量明显比转染空载质粒组病毒相对数量要低。表明BjVip蛋白可以对抗LCDV病毒的复制。而在体内试验中,通过构建原核表达载体表达并验证rBjVip蛋白后与WSSV呼育并注射入虾体中,结果显示,在注射后8到24h,rBjVip蛋白可以显著的降低虾中肌肉和肝胰腺组织中的WSSV病毒的数量,表明rBjVip蛋白具有抗WSSV病毒的功能。
【关键词】：青岛文昌鱼 viperin 抗病毒 正向选择
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78;Q51
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 引言13-22
• 1. Viperin13-19
• 1.1 Viperin的发现13-14
• 1.2 Viperin的结构及其功能14-15
• 1.3 Viperin的亚细胞定位15
• 1.4 Viperin的诱导表达15-16
• 1.5 RNase MRP对viperin表达的调控16
• 1.6 Viperin表达沉默16-17
• 1.7 Viperin的生物学功能17-19
• 2. 文昌鱼19-21
• 2.1 文昌鱼的形态结构19
• 2.2 文昌鱼的生活习性与分布19-20
• 2.3 文昌鱼的进化地位20-21
• 3. 研究的目的、意义及技术路线21-22
• 3.1 研究目的和意义21
• 3.2 技术路线21-22
• 第二章 青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)viperin表达和功能特性22-67
• 1. 前言22
• 2. 材料与方法22-52
• 2.1 实验材料22-25
• 2.1.1 文昌鱼22
• 2.1.2 南美白对虾22-23
• 2.1.3 牙鲆鳃细胞(FG)23
• 2.1.4 对虾白斑综合症病毒(WSSV)与淋巴囊肿病毒(LCDV-cn)23
• 2.1.5 实验试剂23
• 2.1.6 实验仪器23-24
• 2.1.7 菌株与质粒24
• 2.1.8 DNA测序及引物合成24-25
• 2.2 实验方法25-52
• 2.2.1 性成熟青岛文昌鱼的总RNA提取及cDNA合成25-27
• 2.2.2 青岛文昌鱼viperin基因中间片段的克隆27-31
• 2.2.3 青岛文昌鱼viperin基因5’序列的克隆31-33
• 2.2.4 青岛文昌鱼viperin基因3’序列的克隆33-35
• 2.2.5 构建包含全长序列信息的质粒35-36
• 2.2.6 青岛文昌鱼viperin基因序列分析36-37
• 2.2.7 Bjvip表达组织分布研究与poly(I：C)刺激表达情况的研究37-39
• 2.2.8 BjVip成熟蛋白的原核表达39-47
• 2.2.9 rBjVip蛋白抗病毒功能的体内实验47-49
• 2.2.10 BjVip蛋白抗病毒功能的体外试验49-52
• 3. 结果52-64
• 3.1 青岛文昌鱼RNA的提取以及cDNA的合成52
• 3.2 青岛文昌鱼viperin基因中间片段的克隆52-53
• 3.3 青岛文昌鱼viperin基因全长的克隆53-54
• 3.4 青岛文昌鱼viperin基因的生物信息学分析54-60
• 3.4.1 结构分析54-56
• 3.4.2 青岛文昌鱼viperin的进化分析56-60
• 3.5 Bjvip水平组织分布60
• 3.6 Poly(I：C)刺激青岛文昌鱼检测Bjvip的表达情况60-61
• 3.7 青岛文昌鱼viperin基因的原核表达载体构建,蛋白表达与纯化61-62
• 3.8 原核表达重组蛋白的体内抗病毒功能62-63
• 3.9 细胞转染和体外抗病毒功能实验63-64
• 4. 讨论64-67
• 参考文献67-72
• 致谢72-73
• 个人简历73

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