ENO1与IZUMO1的相互作用及对受精的影响
发布时间：2021-10-05 04:52
精子表面的IZUMO1与卵子表面的JUNO之间的相互作用是哺乳动物精卵融合的必需条件,但仅有IZUMO1与JUNO相互作用还不足以导致膜融合,因此一定还有一些精子或卵子蛋白可能参与精卵膜融合。为了进一步寻找可能同JUNO和IZUMO1这两个重要分子有作用的精卵蛋白,实验室利用酵母双杂交技术进行了初步的筛查,筛查后的测序结果表明,一个名为ENO1的蛋白可能与IZUMO1和JUNO存在相互作用。随后本文用酵母双杂交和免疫共沉淀技术鉴定了大鼠ENO1与IZUMO1的相互作用,并用间接免疫荧光技术观察了ENO1在大鼠精子和卵子上的定位以及与IZUMO1的共定位。还用抗体抑制和体外受精技术测定了ENO1对小鼠卵子受精的影响,以鉴定ENO1是否可能参与精卵膜融合过程。实验先克隆了大鼠eno1的cDNA。构建了pGAD-eno1酵母表达载体与实验室已有的pGBK-Juno以及pGBK-Izumo1酵母表达载体进行了酵母双杂交实验。结果表明ENO1与IZUMO1存在相互作用,但与JUNO不存在相互作用。构建了pCMV-Flag-eno1真核表达载体,与实验室已有的pCMV-HA-Izumo1共转染HE...
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
原核表达载体pET-28a-eno1的构建
内蒙古大学硕士学位论文把成功克隆的eno1DNA片段与载体pEASY-Bluntsimple连接后得到重组载体Blunt-eno1，用限制性内切酶BamHI和SalI同时双酶切原核表达载体pET-28a和重组载体Blunt-eno1，将双酶切后的原核表达载体pET-28a片段和eno1片段连接，最终得到重组pET-28a-eno1原核表达载体。Figure2.5ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpET-28a-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedintothevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtosimultaneouslydigesttheprokaryoticexpressionvectorpET-28aandtherecombinantvectorBlunt-eno1,thedouble-digestedprokaryoticexpressionvectorpET-28afragmentandeno1fragmentwereligatedtofinallyobtaintherecombinantpET-28a-eno1prokaryoticexpressionvector.②pGEX-eno1质粒的构建过程如图2.6。图2.6原核表达载体pGEX-eno1的构建把成功克隆的eno1DNA片段与载体pEASY-Bluntsimple连接后得到重组载体Blunt-eno1，用限制性内切酶BamHI和SalI同时双酶切原核表达载体pGEX-4T-1和重组载体Blunt-eno1，将双酶切后的原核表达载体pGEX-4T-1片段和eno1片段连接，最终得到重组pGEX-eno1原核表达载体.Figure2.6ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpGEX-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedwiththevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtodoubledigestthepGEX-eno1Ligase双酶切BamHISalI双酶切BamHISalILigase40
内蒙古大学硕士学位论文相同。此时酵母表达载体pGAD-eno1构建成功，可用后续实验。图2.10Blunt-eno1、pGAD-T7与pGAD-eno1双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果A：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：Blunt-eno1双酶切产物（1630bp）；泳道2：pGAD-T7双酶切产物；B：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：pGAD-eno1双酶切产物（1630bp）。Figure2.10AgarosegelelectrophoresisidentificationofBlunt-eno1,pGADT7andpGAD-eno1doubledigestedproducts.A:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofBlunt-eno1(1630bp).Lane2:doubleenzymedigestionproductofpGAD-T7;B:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofpGAD-eno1(1630bp)3.2.2转化酵母感受态后菌落PCR鉴定LiAc法制备Y2H、Y187酵母感受态，在酵母感受态Y187中转入pGAD-eno1酵母表达载体，酵母感受态Y2H中转入pGBK-Juno、pGBK-Izumo1酵母表达载体。分别挑取SD/-Trp、SD/-Leu固体培养基上生长状态良好的单菌落的一半，充分溶于0.9%的生理盐水，沸水浴中5min后置于-20℃冰冻35min。反复3次后取1μL菌液作为模板进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定结果见图2.11。图A为PCR鉴定转入酵母感受态Y2H中pGBK-Izumo1的电泳结果，图A中特异性条带位于1000bp左右，符合Izumo1预期片段1151bp大校图B为PCR鉴定转入酵母感受态Y2H中pGBK-Juno的电泳结果，图B中特异性条带位于500-750bp之间，符合Juno预期片段609bp大校图C为PCR鉴定转入酵母感受态Y187中pGAD-eno1的电泳结果，图C中特异性条带位于1500-2000bp之间，符合eno1预期片段1630bp大校图2.11结果表明，pGBK-Juno、pGBK-Izumo1、pGAD-eno1酵母表达质粒已成功转入酵母感受态细胞，可用于后续实验。bpM1250020002501001000
【参考文献】：
期刊论文
[1]Progress in the biological function of alpha-enolase[J]. Hong Ji,Jianfa Wang,Jingru Guo,Yue Li,Shuai Lian,Wenjin Guo,Huanmin Yang,Fanzhi Kong,Li Zhen,Li Guo,Yanzhi Liu. Animal Nutrition. 2016(01)
本文编号：3419038
【文章来源】：内蒙古大学内蒙古自治区 211工程院校
【文章页数】：91 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
原核表达载体pET-28a-eno1的构建
内蒙古大学硕士学位论文把成功克隆的eno1DNA片段与载体pEASY-Bluntsimple连接后得到重组载体Blunt-eno1，用限制性内切酶BamHI和SalI同时双酶切原核表达载体pET-28a和重组载体Blunt-eno1，将双酶切后的原核表达载体pET-28a片段和eno1片段连接，最终得到重组pET-28a-eno1原核表达载体。Figure2.5ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpET-28a-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedintothevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtosimultaneouslydigesttheprokaryoticexpressionvectorpET-28aandtherecombinantvectorBlunt-eno1,thedouble-digestedprokaryoticexpressionvectorpET-28afragmentandeno1fragmentwereligatedtofinallyobtaintherecombinantpET-28a-eno1prokaryoticexpressionvector.②pGEX-eno1质粒的构建过程如图2.6。图2.6原核表达载体pGEX-eno1的构建把成功克隆的eno1DNA片段与载体pEASY-Bluntsimple连接后得到重组载体Blunt-eno1，用限制性内切酶BamHI和SalI同时双酶切原核表达载体pGEX-4T-1和重组载体Blunt-eno1，将双酶切后的原核表达载体pGEX-4T-1片段和eno1片段连接，最终得到重组pGEX-eno1原核表达载体.Figure2.6ConstructionofprokaryoticexpressionvectorpGEX-eno1Thesuccessfullyclonedeno1DNAfragmentwasligatedwiththevectorpEASY-BluntsimpletoobtaintherecombinantvectorBlunt-eno1.TherestrictionenzymesBamHIandSalIwereusedtodoubledigestthepGEX-eno1Ligase双酶切BamHISalI双酶切BamHISalILigase40
内蒙古大学硕士学位论文相同。此时酵母表达载体pGAD-eno1构建成功，可用后续实验。图2.10Blunt-eno1、pGAD-T7与pGAD-eno1双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果A：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：Blunt-eno1双酶切产物（1630bp）；泳道2：pGAD-T7双酶切产物；B：泳道M：Marker（DL-2000）；泳道1：pGAD-eno1双酶切产物（1630bp）。Figure2.10AgarosegelelectrophoresisidentificationofBlunt-eno1,pGADT7andpGAD-eno1doubledigestedproducts.A:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofBlunt-eno1(1630bp).Lane2:doubleenzymedigestionproductofpGAD-T7;B:LaneM:Marker(DL-2000);Lane1:doubleenzymedigestionproductofpGAD-eno1(1630bp)3.2.2转化酵母感受态后菌落PCR鉴定LiAc法制备Y2H、Y187酵母感受态，在酵母感受态Y187中转入pGAD-eno1酵母表达载体，酵母感受态Y2H中转入pGBK-Juno、pGBK-Izumo1酵母表达载体。分别挑取SD/-Trp、SD/-Leu固体培养基上生长状态良好的单菌落的一半，充分溶于0.9%的生理盐水，沸水浴中5min后置于-20℃冰冻35min。反复3次后取1μL菌液作为模板进行菌落PCR鉴定，菌落PCR鉴定结果见图2.11。图A为PCR鉴定转入酵母感受态Y2H中pGBK-Izumo1的电泳结果，图A中特异性条带位于1000bp左右，符合Izumo1预期片段1151bp大校图B为PCR鉴定转入酵母感受态Y2H中pGBK-Juno的电泳结果，图B中特异性条带位于500-750bp之间，符合Juno预期片段609bp大校图C为PCR鉴定转入酵母感受态Y187中pGAD-eno1的电泳结果，图C中特异性条带位于1500-2000bp之间，符合eno1预期片段1630bp大校图2.11结果表明，pGBK-Juno、pGBK-Izumo1、pGAD-eno1酵母表达质粒已成功转入酵母感受态细胞，可用于后续实验。bpM1250020002501001000
【参考文献】：
期刊论文
[1]Progress in the biological function of alpha-enolase[J]. Hong Ji,Jianfa Wang,Jingru Guo,Yue Li,Shuai Lian,Wenjin Guo,Huanmin Yang,Fanzhi Kong,Li Zhen,Li Guo,Yanzhi Liu. Animal Nutrition. 2016(01)
本文编号：3419038
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