条斑紫菜HSP70基因的克隆及功能分析

发布时间：2021-10-07 03:44

　　作为有机体受到高温等一些逆境胁迫后大量表达的热应激蛋白,HSP70（Heat Shock protein 70 KDa）蛋白质家族广泛参与生物体内变性蛋白质的复性和降解,以及新生肽的运输、折叠、组装、定位等多种生理过程。编码HSP70蛋白家族的基因在藻类中也是普遍存在的,无论是原始的单细胞藻类还是多细胞的大型藻类,HSP70基因在藻类适应环境的过程中起了极其重要的作用。但有关HSP70在海藻抗逆环境胁迫中的作用一直未得到深入研究。以大型经济海藻条斑紫菜的丝状体为实验材料,克隆得到一条636bp的HSP70基因的EST序列,然后采用3’RACE和5’RACE PCR技术,克隆得到完整的HSP70基因。该基因序列全长为2221bp,预测的HSP70基因的ORF为1992bp,共编码663个氨基酸,5′UTR长度为119 bp,3′UTR长度为110bp,命名为PyHSP70。保守结构域分析表明该基因含有ATPase活性的NBD（nucleotide binding domain）保守结构域。理化性质预测发现,蛋白质分子量为71.7KDa,等电点为4.93,是稳定蛋白质。将PyHSP70基因... 

【文章来源】：辽宁师范大学辽宁省

【文章页数】：61 页

【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 条斑紫菜的生物学
        1.1.1 条斑紫菜
        1.1.2 条斑紫菜生活史
        1.1.3 条斑紫菜的价值
    1.2 HSP的研究进展
        1.2.1 HSP的发现
        1.2.2 HSP的分类和HSP70的结构特点
        1.2.3 HSP70与ATP-ADP转换关系
    1.3 植物中HSP70
        1.3.1 植物中HSP70的分布及亚细胞定位
        1.3.2 植物中HSP70基因的克隆
        1.3.3 植物中HSP70基因的表达
        1.3.4 植物中HSP70的功能
    1.4 本实验研究目的及意义
2 条斑紫菜HSP70基因的克隆及高温诱导下实时定量表达研究
    2.1 实验材料的采集与处理
    2.2 仪器设备及药品
        2.2.1 仪器设备
        2.2.2 实验药品
    2.3 条斑紫菜HSP70基因的克隆
        2.3.1 条斑紫菜丝状体HSP70基因的电子克隆
        2.3.2 总RNA提取与纯化
        2.3.3 反转录
        2.3.4 PCR
        2.3.5 3′-Full RACE
        2.3.6 5′-Full RACE
        2.3.7 纯化PCR产物
        2.3.8 连接、转化、测序
        2.3.9 序列分析
        2.3.10 结果与分析
    2.4.实时荧光定量PCR方法检测高温诱导条斑紫菜HSP70基因的表达情况
        2.4.1 实验方法
        2.4.2 实验结果与分析
3.构建重组表达载体并测定高温胁迫下转pET28a-HSP70菌株的生长情况
    3.1 构建重组表达载体
        3.1.1 目的基因克隆
        3.1.2 构建表达载体
        3.1.3 检测重组载体
        3.1.4 实验结果图
    3.2 测定高温胁迫下转pET28a-HSP70菌株的生长情况
        3.2.1 配制试剂
        3.2.2 实验步骤
        3.2.3 实验结果与分析
4.重组蛋白质的诱导及ATPase活性检测
    4.1 配制试剂
    4.2 重组蛋白的诱导表达
        4.2.1 实验方法
        4.2.2 SDS-PAGE电泳
        4.2.3 重组蛋白质的大量诱导和纯化
        4.2.4 实验结果与分析
    4.3 ATPase活性检测
        4.3.1 BCA法进行蛋白质浓度测定
        4.3.2 ATPase活性检测
        4.3.3 实验结果与分析
5 讨论
6 结论
参考文献
附录
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3421297