大肠杆菌与角叉菜硫代谢基因cysE、cysM和cysC的克

发布时间：2017-05-04 02:10

  本文关键词：大肠杆菌与角叉菜硫代谢基因cysE、cysM和cysC的克隆、表达及生物学特性比较研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：半胱氨酸及非蛋白质氨基酸在科研和医药领域都有广泛的用途。半胱氨酸及非蛋白质氨基酸酶的生物催化与发酵生产因其节能、高效、环保而越来越受到重视。本文中克隆了大肠杆菌和海藻角叉菜的硫代谢相关基因cysE、cysM和cysC;利用在大肠杆菌中高效表达的同源或异源丝氨酸乙酰转移酶(SAT)和O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASS-B),获得大量活性稳定的重组酶(生物催化剂);以各种亲核试剂为底物,利用在大肠杆菌中高效重组表达的重组酶合成非蛋白质氨基酸,为下一步通过多酶体系合成半胱氨酸和含硫非蛋白质氨基酸奠定前期工作基础。本论文首先克隆得到cysE-ECOLI基因,其ORF区长822 bp,编码273个氨基酸,理论分子量为29.32 kDa,理论等电点为6.05。将cysE-ECOLI基因连接到pET-22b(+)表达载体上并进行原核表达,得到在上清液中重组表达的可溶性蛋白,经纯化后,获得了具有活性的重组蛋白,纯化后的酶活性为180 U/mg。为了获得表达量更高,催化活性更强,更适合大量生产的SAT,本论文首次克隆得到了角叉菜cysE(cysE-CHCR)基因,其ORF区长1143 bp,编码380个氨基酸,理论分子量为40.60 kDa,理论等电点为6.26。通过基因克隆及生物信息学方法对基因进行分析预测,为下一步重组表达、活性检测等研究奠定基础。其次,本论文克隆得到大肠杆菌cysM基因,其ORF区长912 bp,编码303个氨基酸,理论分子量为32.63 kDa,理论等电点为5.42。重组蛋白OASS-B在上清液中以可溶性蛋白形式获得高效表达,重组蛋白经多步纯化后获得高度纯化的酶,其活性为728U/mg。重组酶OASS-B与不同浓度的OAS合成了含硫非蛋白质氨基酸:β-吡唑丙氨酸(β-PA)和β-三氮唑丙氨酸(β-TA),产物β-PA和β-TA的量与OAS浓度成正相关。经过抽滤,洗涤,干燥后,产物为白色晶体状粉末。证明重组表达的OASS-B能够通过改变亲核试剂,催化合成不同的含硫非蛋白质氨基酸。最后,本论文首次克隆得到角叉菜cysC基因(编码腺嘌呤-5'-磷酸硫酸激酶,APSK),其ORF区长699 bp,编码232个氨基酸,理论分子量为25.33 kDa,理论等电点为8.48。对其氨基酸序列与其他物种进行比对分析,并对其理化性质、结构特点及其系统发育进行了研究。
【关键词】：大肠杆菌 角叉菜 丝氨酸乙酰转移酶 乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶-B 腺嘌呤-5'-磷酸硫酸激酶
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-6
• 缩略语表6-11
• 第1章 引言11-24
• 1.1 硫的吸收与利用11-15
• 1.1.1 硫营养的重要性11-12
• 1.1.2 植物对硫的吸收与运输12-13
• 1.1.3 硫的同化利用13-15
• 1.2 硫代谢相关基因研究进展15-21
• 1.2.1 亚硫酸盐还原酶15-17
• 1.2.2 CysB蛋白17-19
• 1.2.3 半胱氨酸合成酶19-20
• 1.2.4 APS激酶20-21
• 1.3 硫代谢相关基因在含硫氨基酸合成中的应用21-23
• 1.4 本研究的目的与意义23-24
• 第2章 大肠杆菌、角叉菜cysE基因的克隆、表达及生物学特性24-51
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 菌株与载体24
• 2.1.2 植物材料24-25
• 2.1.3 主要试剂25
• 2.1.4 主要仪器25-26
• 2.2 方法26-38
• 2.2.1 大肠杆菌、角叉菜cysE基因的分子克隆26-34
• 2.2.2 cysE生物信息学分析34
• 2.2.3 cysE-ECOLI的原核表达及酶活测定34-38
• 2.3 实验结果38-50
• 2.3.1 cysE基因的分子克隆38-40
• 2.3.2 cysE生物信息学分析40-49
• 2.3.3 cysE-ECOLI基因的原核表达载体构建49
• 2.3.4 重组SAT的表达、纯化及酶活测定49-50
• 2.4 讨论50-51
• 第3章 大肠杆菌cysM基因的克隆、表达及生物学特性51-62
• 3.1 材料51
• 3.1.1 菌株与载体51
• 3.1.2 主要试剂51
• 3.1.3 主要仪器51
• 3.2 方法51-55
• 3.2.1 cysM基因的分子克隆51-52
• 3.2.2 OASS-B的生物信息学分析52
• 3.2.3 cysM基因的原核表达52-55
• 3.3 实验结果55-61
• 3.3.1 cysM基因的分子克隆55
• 3.3.2 OASS-B的生物信息学分析55-58
• 3.3.3 cysM基因的原核表达58-60
• 3.3.4 OASS-B催化非蛋白质氨基酸的合成60-61
• 3.4 讨论61-62
• 第4章 角叉菜cysC基因的分子克隆及信息学分析62-69
• 4.1 材料62
• 4.1.1 菌株与载体62
• 4.1.2 植物材料62
• 4.1.3 主要试剂62
• 4.1.4 主要仪器62
• 4.2 方法62-63
• 4.2.1 角叉菜cysC基因的分子克隆62-63
• 4.2.2 角叉菜cysC基因的生物信息学分析63
• 4.3 实验结果63-68
• 4.3.1 cysC基因的分子克隆63
• 4.3.2 cysC生物信息学分析63-68
• 4.4 讨论68-69
• 全文总结69-70
• 本文创新点70-71
• 参考文献71-76
• 附录A pET-22b(+)质粒图谱76-77
• 附录B 不同物种SAT的FASTA格式氨基酸序列（Uniprot）77-80
• 附录C 不同物种APSK的FASTA格式氨基酸序列（Uniprot）80-83
• 攻读硕士学位期间发表学术论文情况83-84
• 致谢84

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1 齐冬青;大肠杆菌与角叉菜硫代谢基因cysE、cysM和cysC的克隆、表达及生物学特性比较研究[D];辽宁师范大学;2015年

2 王黛青;结核分枝杆菌CysE的酶促反应特性分析[D];大连医科大学;2010年

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本文编号：344197