P2X7受体调节脂肪干细胞分化为雪旺样细胞的作用研究
发布时间：2021-10-17 16:22
目的:脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells,ADSCs）是神经移植,治疗缺损神经的理想型细胞,但移植后死亡率高是亟待处理的难题。P2X7受体是神经系统疾病研究的热门靶点,已知P2X7受体能够拯救ATP诱发的ADSCs死亡,介导雪旺细胞向髓鞘型分化,促进髓鞘形成。本实验主要研究P2X7受体对脂肪干细胞是否具有促进其分化为雪旺样细胞的作用,对ADSCs分化后促神经再生功能的影响,为神经修复细胞疗法寻觅药物干预靶点提供理论根据。方法:取雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠腹股沟脂肪,Ⅰ型胶原酶消化法分离脂肪干细胞,培养传代,选用第三代细胞用于后续实验。用P2X7R（P2X7受体）慢病毒转染第三代未分化脂肪干细胞（uADSCs）,构建uADSCs高表达P2X7R模型,Western blot验证P2X7R-uADSCs转染是否成功。MTT检测转染前后ADSCs增殖能力。将uADSCs和P2X7R-uADSCs以1×105/mL的密度种入六孔板中,加入1 mMβ-巯基乙醇培养24 h,再加入35 ng/mL全反式维甲酸,孵育72 h后,换...
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
所示ADSCs的形态特征变化
兰州大学硕士学位论文P2X7受体调节脂肪干细胞分化为雪旺样细胞的作用研究23几乎没有荧光；MOI=20时，少量ADSCs表达GFP，并且荧光强度较弱；MOI=30的情况下，阳性ADSCs数目和荧光强度均会增加；当MOI=50时，荧光强度增强，阳性细胞数大增，细胞活力好；MOI=100时，转染的ADSCs形态发生变化，而死亡细胞增多。结果显示，MOI=50时转染率较高，故可选作本实验慢病毒载体最佳转染复数。图2不同MOI转染ADSCs72h后GFP荧光表达。病毒转染后，72h后可见明显绿色荧光，ADSCs表达荧光的数量和强度与MOI呈正相关。MOI:A=0，B=20，C=30，D=50，E=100。(A、B、C、D：倒置显微镜×100，E：倒置显微镜×10)Figure2FluorescenceexpressionofGFPinADSCstransfectedwithdifferentMOIfor72h.Aftertransfectionfor72h,obviousgreenfluorescencewasobserved,theamountandintensityoffluorescenceexpressedbyADSCswerepositivelycorrelatedwithMOI.MOI:A=0,B=20,C=30,D=50,E=100.(A.B.C.D:invertedmicroscope×100,E:invertedmicroscope×10)3.2.2慢病毒转染ADSCsADSCs按照1×105个/mL细胞密度接种于六孔板后，待细胞融合60%-80%后，弃去培养基，加入5μg/mL的聚凝胺溶液，37℃，5%CO2培养箱中孵育30min后，再按照MOI=50加入Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)，培养12-16h后，换取新鲜DMEM/F12培养基继续孵育。MOI=50时，在荧光显微镜下观察转染慢病毒载体Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和转染P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)72h后，uADSCs细胞的GFP绿色
兰州大学硕士学位论文P2X7受体调节脂肪干细胞分化为雪旺样细胞的作用研究24荧光表达量，其感染率均可达90%以上(图3A.B)。图3ADSCs荧光表达。A.GFP-uADSCs；B.P2X7R-uADSCs。MOI=50时，荧光显微镜下观察荧光，A、B组荧光表达基本一致。Figure3FluorescenceexpressionofADSCs.A.GFP-uADSCs;B.P2X7R-uADSCs.Thefluorescencewasobservedunderafluorescencemicroscope,andthefluorescenceintensityoftheA,BgroupwasbasicallythesamewhenMOI=50.3.3慢病毒转染uADSCs鉴定慢病毒载体转染uADSCs后，细胞生长状态良好，Westernblot鉴定P2X7R高表达模型结果显示，uADSCs组，GFP-uADSCs对照组，P2X7R转染组细胞均表达P2X7，uADSCs组和对照组的蛋白表达量明显低于P2X7R转染组（**P＜0.01，***P＜0.001），可证明P2X7R转染成功（图4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]周围神经学组建设与学术进展[J]. 顾立强. 中国修复重建外科杂志. 2018(07)
[2]Current progress in use of adipose derived stem cells in peripheral nerve regeneration[J]. Shomari DL Zack-Williams,Peter E Butler,Deepak M Kalaskar. World Journal of Stem Cells. 2015(01)
[3]雪旺细胞体外培养与纯化的研究进展[J]. 付红运,王锐英. 海南医学. 2012(22)
本文编号：3442061
【文章来源】：兰州大学甘肃省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：61 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
所示ADSCs的形态特征变化
兰州大学硕士学位论文P2X7受体调节脂肪干细胞分化为雪旺样细胞的作用研究23几乎没有荧光；MOI=20时，少量ADSCs表达GFP，并且荧光强度较弱；MOI=30的情况下，阳性ADSCs数目和荧光强度均会增加；当MOI=50时，荧光强度增强，阳性细胞数大增，细胞活力好；MOI=100时，转染的ADSCs形态发生变化，而死亡细胞增多。结果显示，MOI=50时转染率较高，故可选作本实验慢病毒载体最佳转染复数。图2不同MOI转染ADSCs72h后GFP荧光表达。病毒转染后，72h后可见明显绿色荧光，ADSCs表达荧光的数量和强度与MOI呈正相关。MOI:A=0，B=20，C=30，D=50，E=100。(A、B、C、D：倒置显微镜×100，E：倒置显微镜×10)Figure2FluorescenceexpressionofGFPinADSCstransfectedwithdifferentMOIfor72h.Aftertransfectionfor72h,obviousgreenfluorescencewasobserved,theamountandintensityoffluorescenceexpressedbyADSCswerepositivelycorrelatedwithMOI.MOI:A=0,B=20,C=30,D=50,E=100.(A.B.C.D:invertedmicroscope×100,E:invertedmicroscope×10)3.2.2慢病毒转染ADSCsADSCs按照1×105个/mL细胞密度接种于六孔板后，待细胞融合60%-80%后，弃去培养基，加入5μg/mL的聚凝胺溶液，37℃，5%CO2培养箱中孵育30min后，再按照MOI=50加入Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)，培养12-16h后，换取新鲜DMEM/F12培养基继续孵育。MOI=50时，在荧光显微镜下观察转染慢病毒载体Lenti-CMV-GFP-2A-Puro-BlankLentivirus和转染P2X7RLentivirus(Rat)(CMV)(pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro)72h后，uADSCs细胞的GFP绿色
兰州大学硕士学位论文P2X7受体调节脂肪干细胞分化为雪旺样细胞的作用研究24荧光表达量，其感染率均可达90%以上(图3A.B)。图3ADSCs荧光表达。A.GFP-uADSCs；B.P2X7R-uADSCs。MOI=50时，荧光显微镜下观察荧光，A、B组荧光表达基本一致。Figure3FluorescenceexpressionofADSCs.A.GFP-uADSCs;B.P2X7R-uADSCs.Thefluorescencewasobservedunderafluorescencemicroscope,andthefluorescenceintensityoftheA,BgroupwasbasicallythesamewhenMOI=50.3.3慢病毒转染uADSCs鉴定慢病毒载体转染uADSCs后，细胞生长状态良好，Westernblot鉴定P2X7R高表达模型结果显示，uADSCs组，GFP-uADSCs对照组，P2X7R转染组细胞均表达P2X7，uADSCs组和对照组的蛋白表达量明显低于P2X7R转染组（**P＜0.01，***P＜0.001），可证明P2X7R转染成功（图4）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]周围神经学组建设与学术进展[J]. 顾立强. 中国修复重建外科杂志. 2018(07)
[2]Current progress in use of adipose derived stem cells in peripheral nerve regeneration[J]. Shomari DL Zack-Williams,Peter E Butler,Deepak M Kalaskar. World Journal of Stem Cells. 2015(01)
[3]雪旺细胞体外培养与纯化的研究进展[J]. 付红运,王锐英. 海南医学. 2012(22)
本文编号：3442061
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