羊源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及检测方法的建立
发布时间：2021-10-19 03:05
肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一种条件性致病菌,容易产生耐药性,可以引起人和多种动物患病,导致脑膜炎、肺炎、泌尿系统发炎、伤口感染甚至败血症等,在养羊业中一直未被人们所重视,但是随着近年来养羊业的快速发展,各种抗生素的广泛使用甚至滥用,高密度养殖和快速育肥的饲养模式,使该菌对养羊业的危害也越来越大。但关于羊源肺炎克雷伯氏菌的临床检测方法并没有深入的研究,因此,建立肺炎克雷伯氏菌的临床检测方法是控制该病的前提条件。本研究从发病羊肺脏中分离鉴定出肺炎克雷伯氏菌,并建立了间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测方法、间接免疫荧光（IFA）检测方法,为肺炎克雷伯氏菌快速诊断试剂盒的研制奠定了基础。本研究从羊肺脏中分离到2株细菌,分离菌均在LB培养基上形成灰白色、圆形凸起、边缘整齐、湿润且黏稠的菌落,可以挑起易拉成丝;革兰氏染色为革兰氏阴性菌。将两株分离菌株以2×109 CFU/mL的浓度接种昆明小鼠0.2 mL/只后8 h内小鼠均死亡,从死亡小鼠肺脏中又分离到接种菌;生化试验结果符合肺炎克雷伯氏菌的生化特性,药敏试验发现对头孢类、氨基糖苷类等...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1分离菌株在三种培养基的生长状况
山东农业大学硕士专业学位论文173结果与分析3.1羊源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定结果3.1.1细菌形态学观察利用细菌分离的方法，从被检的12份羊源病料中分离得到2株疑似菌株KpY1、KpY2。将分离菌KpY1、KpY2分别在LB培养基、伊红美蓝培养基、绵羊血培养基上纯培养，两株菌均在LB培养基上形成灰白色、圆形凸起、边缘整齐、湿润且黏稠的菌落，可以挑起易拉成丝（图1-1A、D）。在绵羊血培养基上形成白色黏稠的菌落，不溶血（图1-1B、E）。在伊红美蓝培养基上形成灰白色、圆形凸起、湿润且黏稠的菌落（图1-1C、F）。将分离菌进行革兰氏染色镜检，由油镜下观察到分离菌均为革兰氏阴性菌、短杆菌（图1-2）。图1-1分离菌株在三种培养基的生长状况A~C分离菌KpY1在LB培养基、绵羊血培养基和伊红美蓝培养基生长状况；D~F分离菌KpY2在LB培养基、绵羊血培养基和伊红美蓝培养基生长状况Figure1-1Growthofisolatedstrainsinthreemedia.A~CGrowthstatusofisolateKpY1inLBmedium,goatbloodmediumandeosinbluemedium;D~FGrowthstatusofisolateKpY2inLBmedium,goatbloodmediumandeosinbluemedium图1-2分离菌株革兰氏染色结果1000×Figure1-2Gramstainingresultsofisolatedstrain1000×
山东农业大学硕士专业学位论文21图2-1分离菌株16srRNA基因片段电泳图Figure2-1Electrophoresisof16srRNAgenefragmentofisolatedstrain图2-2分离菌株特异性基因片段电泳图Figure2-2Electrophoresisdiagramofisolatedstrain-specificgenefragments3.1.6同源性分析将KpY1、KpY2株的16SrRNA基因片段测序并进行同源性分析，结果表明，两株分离菌株与GenBank中收录的肺炎克雷伯氏菌多个参考菌株核苷酸序列的同源性最高为99.3%和99.5%，结果表明分离到的两株菌为肺炎克雷伯氏菌，并将两株菌命名为KpY1、KpY2。将KpY1、KpY2，同实验室保存的KpJ1、KpM1、KpM3、KpM4、KpM10以及由NCBI下载的参考菌株5株的16srRNA基因序列运用DNAStar软件进行同源性分析，结果发现分离株KpY1同KpY2之间的同源性为99.3%，与鸡源菌株的同源性为97.3%，同毛皮动物源菌株的同源性在97.3~99.3%之间，与参考菌株的同源性在均99.3%；而分离株KpY2与鸡源菌株的同源性在97.5%，与毛皮动物源菌株的同源性在97.5~99.4%之间。与参考菌株的同源性在99.3~99.5%之间。通过以上数据我们可以发现，不同动物来源肺炎克雷伯氏菌之间存在一定差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高黏型肺炎克雷伯菌分子流行病学特点[J]. 郑璐,康海全,赵树龙,王彦玲,顾兵,马萍,李洪春. 中华医院感染学杂志. 2020(04)
[2]肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶检测方法的研究进展[J]. 孙铭艳,吴倩倩,陶元勇. 中国医学装备. 2020(02)
[3]肺炎克雷伯氏菌毒力因子及其基因组学研究进展[J]. 赵位,喻东,程建国,李秋波,王印,杨泽晓,姚学萍,罗燕. 安徽农业大学学报. 2019(06)
[4]致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分析[J]. 曹敬荣,王欣蕊,陈典典,王岩,段园园,李文军,谢威,闵嵘,王培昌. 国际检验医学杂志. 2019(24)
[5]高毒力肺炎克雷伯菌血清型、毒力基因分布及分子标志物探索[J]. 徐水宝,杨思宇,翁珊珊,陈晨,陈澍,张文宏,金嘉琳. 微生物与感染. 2019(06)
[6]头孢哌酮分别联合庆大霉素、阿米卡星治疗克雷伯杆菌肺炎的效果比较[J]. 岳恒君,王辉. 中国合理用药探索. 2019(12)
[7]貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮类药物耐药表型及耐药基因检测[J]. 张召兴,刘少杰,苏硕青,周琦,贾青辉,张艳英,史秋梅. 野生动物学报. 2019(04)
[8]耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌在医院获得性肺炎中的流行病学与耐药性分析[J]. 李向欣,何秀娟,程小龙. 中国病原生物学杂志. 2019(10)
[9]2014-2017年某院肺炎克雷伯菌分布及耐药性分析[J]. 周馨,马筱玲,戴媛媛,黄家祥,王影. 中华医院感染学杂志. 2019(21)
[10]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对耐碳青霉烯类药肺炎克雷伯菌膜孔蛋白检测分析[J]. 涂海健,黄亚雨,许光辉,陈淑娟,林伟. 中国预防医学杂志. 2019(10)
硕士论文
[1]肠道微生态与肺炎克雷伯菌引起肝脓肿感染的关系研究[D]. 金同同.河北大学 2019
[2]貂源肺炎克雷伯菌的生物学特性及致病性研究[D]. 韩坤.中国农业科学院 2019
[3]多重耐药肺炎克雷伯菌所致医院获得性感染的预后相关因素分析[D]. 王璐.吉林大学 2019
[4]肺炎克雷伯菌转录调控子RcsAB对荚膜多糖相关基因调控关系的研究[D]. 彭丹.重庆医科大学 2019
[5]肺炎克雷伯菌转录调控子CRP对KP10324基因的转录调控研究[D]. 何蔷.重庆医科大学 2019
[6]肺炎克雷伯菌KP12626基因参与菌株毒力的初步研究[D]. 张仲双.重庆医科大学 2019
[7]山东省水貂胴体及内脏组织四种病原菌调查、分离鉴定[D]. 李鹏.山东农业大学 2019
[8]6株高毒力肺炎克雷伯菌全基因组测序及比较基因组学分析[D]. 刘品.重庆医科大学 2018
[9]貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因的检测及其致病性研究[D]. 王建莉.山东农业大学 2017
[10]ST11型产KPC-2非K1/K2荚膜血清型高毒力肺炎克雷伯菌耐药机制及毒力研究[D]. 林迪.浙江大学 2017
本文编号：3444029
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图1-1分离菌株在三种培养基的生长状况
山东农业大学硕士专业学位论文173结果与分析3.1羊源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定结果3.1.1细菌形态学观察利用细菌分离的方法，从被检的12份羊源病料中分离得到2株疑似菌株KpY1、KpY2。将分离菌KpY1、KpY2分别在LB培养基、伊红美蓝培养基、绵羊血培养基上纯培养，两株菌均在LB培养基上形成灰白色、圆形凸起、边缘整齐、湿润且黏稠的菌落，可以挑起易拉成丝（图1-1A、D）。在绵羊血培养基上形成白色黏稠的菌落，不溶血（图1-1B、E）。在伊红美蓝培养基上形成灰白色、圆形凸起、湿润且黏稠的菌落（图1-1C、F）。将分离菌进行革兰氏染色镜检，由油镜下观察到分离菌均为革兰氏阴性菌、短杆菌（图1-2）。图1-1分离菌株在三种培养基的生长状况A~C分离菌KpY1在LB培养基、绵羊血培养基和伊红美蓝培养基生长状况；D~F分离菌KpY2在LB培养基、绵羊血培养基和伊红美蓝培养基生长状况Figure1-1Growthofisolatedstrainsinthreemedia.A~CGrowthstatusofisolateKpY1inLBmedium,goatbloodmediumandeosinbluemedium;D~FGrowthstatusofisolateKpY2inLBmedium,goatbloodmediumandeosinbluemedium图1-2分离菌株革兰氏染色结果1000×Figure1-2Gramstainingresultsofisolatedstrain1000×
山东农业大学硕士专业学位论文21图2-1分离菌株16srRNA基因片段电泳图Figure2-1Electrophoresisof16srRNAgenefragmentofisolatedstrain图2-2分离菌株特异性基因片段电泳图Figure2-2Electrophoresisdiagramofisolatedstrain-specificgenefragments3.1.6同源性分析将KpY1、KpY2株的16SrRNA基因片段测序并进行同源性分析，结果表明，两株分离菌株与GenBank中收录的肺炎克雷伯氏菌多个参考菌株核苷酸序列的同源性最高为99.3%和99.5%，结果表明分离到的两株菌为肺炎克雷伯氏菌，并将两株菌命名为KpY1、KpY2。将KpY1、KpY2，同实验室保存的KpJ1、KpM1、KpM3、KpM4、KpM10以及由NCBI下载的参考菌株5株的16srRNA基因序列运用DNAStar软件进行同源性分析，结果发现分离株KpY1同KpY2之间的同源性为99.3%，与鸡源菌株的同源性为97.3%，同毛皮动物源菌株的同源性在97.3~99.3%之间，与参考菌株的同源性在均99.3%；而分离株KpY2与鸡源菌株的同源性在97.5%，与毛皮动物源菌株的同源性在97.5~99.4%之间。与参考菌株的同源性在99.3~99.5%之间。通过以上数据我们可以发现，不同动物来源肺炎克雷伯氏菌之间存在一定差异。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高黏型肺炎克雷伯菌分子流行病学特点[J]. 郑璐,康海全,赵树龙,王彦玲,顾兵,马萍,李洪春. 中华医院感染学杂志. 2020(04)
[2]肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶检测方法的研究进展[J]. 孙铭艳,吴倩倩,陶元勇. 中国医学装备. 2020(02)
[3]肺炎克雷伯氏菌毒力因子及其基因组学研究进展[J]. 赵位,喻东,程建国,李秋波,王印,杨泽晓,姚学萍,罗燕. 安徽农业大学学报. 2019(06)
[4]致多部位感染肺炎克雷伯菌的毒力分析[J]. 曹敬荣,王欣蕊,陈典典,王岩,段园园,李文军,谢威,闵嵘,王培昌. 国际检验医学杂志. 2019(24)
[5]高毒力肺炎克雷伯菌血清型、毒力基因分布及分子标志物探索[J]. 徐水宝,杨思宇,翁珊珊,陈晨,陈澍,张文宏,金嘉琳. 微生物与感染. 2019(06)
[6]头孢哌酮分别联合庆大霉素、阿米卡星治疗克雷伯杆菌肺炎的效果比较[J]. 岳恒君,王辉. 中国合理用药探索. 2019(12)
[7]貉源致病性肺炎克雷伯氏菌对喹诺酮类药物耐药表型及耐药基因检测[J]. 张召兴,刘少杰,苏硕青,周琦,贾青辉,张艳英,史秋梅. 野生动物学报. 2019(04)
[8]耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌在医院获得性肺炎中的流行病学与耐药性分析[J]. 李向欣,何秀娟,程小龙. 中国病原生物学杂志. 2019(10)
[9]2014-2017年某院肺炎克雷伯菌分布及耐药性分析[J]. 周馨,马筱玲,戴媛媛,黄家祥,王影. 中华医院感染学杂志. 2019(21)
[10]基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对耐碳青霉烯类药肺炎克雷伯菌膜孔蛋白检测分析[J]. 涂海健,黄亚雨,许光辉,陈淑娟,林伟. 中国预防医学杂志. 2019(10)
硕士论文
[1]肠道微生态与肺炎克雷伯菌引起肝脓肿感染的关系研究[D]. 金同同.河北大学 2019
[2]貂源肺炎克雷伯菌的生物学特性及致病性研究[D]. 韩坤.中国农业科学院 2019
[3]多重耐药肺炎克雷伯菌所致医院获得性感染的预后相关因素分析[D]. 王璐.吉林大学 2019
[4]肺炎克雷伯菌转录调控子RcsAB对荚膜多糖相关基因调控关系的研究[D]. 彭丹.重庆医科大学 2019
[5]肺炎克雷伯菌转录调控子CRP对KP10324基因的转录调控研究[D]. 何蔷.重庆医科大学 2019
[6]肺炎克雷伯菌KP12626基因参与菌株毒力的初步研究[D]. 张仲双.重庆医科大学 2019
[7]山东省水貂胴体及内脏组织四种病原菌调查、分离鉴定[D]. 李鹏.山东农业大学 2019
[8]6株高毒力肺炎克雷伯菌全基因组测序及比较基因组学分析[D]. 刘品.重庆医科大学 2018
[9]貂源肺炎克雷伯氏菌血清型和毒力基因的检测及其致病性研究[D]. 王建莉.山东农业大学 2017
[10]ST11型产KPC-2非K1/K2荚膜血清型高毒力肺炎克雷伯菌耐药机制及毒力研究[D]. 林迪.浙江大学 2017
本文编号：3444029
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