玉米NAC类转录因子ZmNAC19和ZmNAC31的克
发布时间：2021-10-23 04:42
NAC是高等植物所特有的一类转录因子,它在植物的生长发育、花药开裂及逆境胁迫中具有重要作用。玉米生育期内由于高温、高湿等环境因素造成花药不能开裂从而严重影响玉米产量。拟南芥中的NAC类基因不仅参与叶片的发育,还调控花药开裂。而玉米中的NAC类基因研究较少,为了研究玉米中调控叶片和花药开裂的NAC类基因,本文对玉米中的NAC类基因进行筛选,筛选出ZmNAC19基因主要在叶里面表达,ZmNAC31基因主要在雄穗和叶里面表达。将筛选出的基因进行生物信息学分析、构建GFP融合蛋白载体和过表达载体、获取过表达转基因拟南芥并进行表型分析。主要成果如下:1.通过比对拟南芥中NST蛋白序列,从玉米中筛选出100个NAC基因,又结合转录组数据,筛选出33个基因,最后通过RT-PCR筛选出在叶里表达的ZmNAC19基因和在雄穗里表达的ZmNAC31基因。通过生物信息学分析ZmNAC19和ZmnAC31基因的启动子序列,这两个基因的启动子区均有NAC转录的顺式作用元件,尤其存在与次生壁增厚的调控元件,说明这两个基因可能参与了植物的次生壁增厚;对ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的信号肽和跨膜结构预测,预测出...
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米花药发育14个时期的细胞学观察（引自田有辉和万向元,2018）
第一章文献综述12图1-2拟南芥花药的隔膜和裂缝区（引自Wilsonetal.,2011）Fig.1-2SeptumandstomiumregionofanArabidopsisanther注：A：小孢子释放后的裂缝区；箭头表示内层细胞次生增厚带。B：隔膜和裂缝溶解时的结构图。En：内皮层St：裂缝S：隔膜Note:A:Thestomiumregionaftermicrosporerelease;bandsofsecondarythckening(arrows)canbeobservedintheendothecium.B:Thestomiumregionatantherdehiscence,afterseptumandstomiumlysis.En,endothecium;St,stomium,S,septum.BonnerandDickinson（1989）通过番茄的显微镜观察发现，孢子囊间隔的发育和表皮细胞的分化是由孢子细胞和绒毡层的分化引起的，之后是内皮层的分化。内皮层细胞进行选择性的次生增厚，而小室之间的隔膜和裂缝区域不增厚（Koltunowetal.,1990）。这说明内皮层的选择性次生增厚对于花药的开裂至关重要。花药开裂之前，隔膜经历细胞分裂和细胞编程性死亡（Marianaetal.,1990）。裂缝对花药开裂的重要性已经在番茄的细胞消融中得以证实（BealsandGoldberg,1997）。他们指出，裂缝特异性消融后会使花药开裂失败。双子叶模式植物拟南芥（Sandersetal.,1999）与茄科植物（BonnerandDickinson,1989；Sandersetal.,2005），单子叶植物水稻（Matsuietal.,1999）和玉米（Keijzeretal.,1996）的花药开裂过程相似，这说明控制花药开裂的相关基因在不同的物种中具有高度保守性。但是，不同物种之间的花药结构也存在着细小的差异，从而影响最终开裂的位置。由于不同物种花药结构存在细小差异，从形态和组织学特征方面，研究人员分析了30种茄科植物的花药开裂和裂缝结构，观察到三种主要的开裂机制：（a）孔裂，通过一个小的顶端孔开裂；（b）顶端口纵向开裂，有一个顶端孔，但开口继续向下纵向分
沈阳农业大学硕士学位论文21利用在线工具TMHMMServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的跨膜结构；利用在线工具SignalPServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白质N端的信号肽。2.1.2.8玉米ZmNAC19和ZmNAC31蛋白质二级结构预测利用在线工具ProtParam、SOPMA和SWISSMODEL对ZmNAC19和ZmNAC31进行蛋白质一级、二级和三级结构预测。2.2结果与分析2.2.1玉米各组织总RNA的提取及花药、叶片高表达NAC基因的鉴定根据RNA提取试剂盒的说明书提取玉米拔节期的根、茎、叶，花丝，授粉前的雌穗，抽穗后的雄穗和形成期的种子的总RNA。结果如图2-1所示，可以清晰地看见28S和18S两条带，说明RNA提取成功。测定A260/A280后，发现所有样品RNA纯度都较好，可以用于下一步的反转录以及RT-PCR试验。图2-1玉米不同组织的总RNAFig.2-1TotalRNApreparationfromdifferenttissueofmaize注：Root：根；Stem：茎；Leaf：叶；Pistil：雌穗；Silk：花丝；Tassel：雄穗；Seed：种子因为Mitsuda等人（2007）在研究NST1和NST2基因时发现，这两个基因在调节叶片和花药的次生壁增厚过程中发挥重要功能，以及在水稻、小麦中也有研究表明NAC类基因调节植物叶片的衰老和花药开裂，因此，通过比对拟南芥长角果开裂相关基因NST的蛋白质序列，在玉米数据库中筛选出100个NAC类基因，结合相似性大小与转录组数据中叶和花药中的表达量多少，从初次筛选的100个基因中筛选出33个基因可能与花药的开裂、叶片的发育有关。为了检测该33个基因在玉米各个组织中的表达量，将RNA反转录成cDNA，再将筛选出的33个基因进行RT-PCR水平检测，33个基因在不同组织中的表达水平如表2-2所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米花药发育的细胞生物学与分子遗传学的研究方法[J]. 田有辉,万向元. 中国生物工程杂志. 2018(01)
[2]‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析[J]. 闫朝辉,李桂荣,穆金燕,娄航通,朱自果. 园艺学报. 2016(04)
[3]Cotton GhMYB7 is predominantly expressed in developing fibers and regulates secondary cell wall biosynthesis in transgenic Arabidopsis[J]. Junfeng Huang,Feng Chen,Siyu Wu,Juan Li,Wenliang Xu. Science China（Life Sciences）. 2016(02)
[4]非生物逆境相关基因在棉花抗逆研究中的进展[J]. 雷志,周美亮,吴燕民. 中国农业科技导报. 2014(02)
[5]植物NAC转录因子的研究进展[J]. 康桂娟,曾日中,聂智毅,黎瑜,代龙军,段翠芳. 生物技术通报. 2012(11)
[6]棉花叶片纤维素和木质素含量与绿盲蝽抗性的关系[J]. 雒珺瑜,崔金杰,辛惠江. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2012(04)
[7]Cytological analysis and genetic control of rice anther development[J]. Dabing Zhang~(a,b,*),Xue Luo~a,Lu Zhu~a a Institute of Plant Science,State Key Laboratory of Hybrid Rice,School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China b Bio-X Research Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China. 遗传学报. 2011(09)
[8]植物NAC转录因子的研究进展[J]. 冶晓芳,唐益苗,高世庆,杨颖,刘美英,王永波,赵昌平. 生物技术通报. 2009(10)
博士论文
[1]两个玉米近等基因系叶夹角差异的蛋白质组学研究[D]. 王宁.河南农业大学 2017
[2]鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2参与逆境胁迫响应的功能分析[D]. 于兴旺.南京农业大学 2014
[3]水稻抗逆转录因子SNAC1靶基因的分离和功能分析[D]. 游均.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]玉米花分生组织基因ZmMADS35的功能浅析[D]. 赵若冰.沈阳农业大学 2019
[2]华中五味子不同时期木质素和木脂素含量变化及其合成关键酶CCR基因的研究[D]. 周势超.陕西师范大学 2018
[3]玉米干旱胁迫应答NAC基因的克隆及功能分析[D]. 张丽.西北农林科技大学 2017
[4]杨树PtoMYB170转录因子在次生壁合成调控及抗旱中的功能研究[D]. 刘瑞.西南大学 2016
[5]毛白杨MYB055转录因子在次生壁合成中的调控机制研究[D]. 叶胜龙.西南大学 2015
本文编号：3452489
【文章来源】：沈阳农业大学辽宁省
【文章页数】：78 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
玉米花药发育14个时期的细胞学观察（引自田有辉和万向元,2018）
第一章文献综述12图1-2拟南芥花药的隔膜和裂缝区（引自Wilsonetal.,2011）Fig.1-2SeptumandstomiumregionofanArabidopsisanther注：A：小孢子释放后的裂缝区；箭头表示内层细胞次生增厚带。B：隔膜和裂缝溶解时的结构图。En：内皮层St：裂缝S：隔膜Note:A:Thestomiumregionaftermicrosporerelease;bandsofsecondarythckening(arrows)canbeobservedintheendothecium.B:Thestomiumregionatantherdehiscence,afterseptumandstomiumlysis.En,endothecium;St,stomium,S,septum.BonnerandDickinson（1989）通过番茄的显微镜观察发现，孢子囊间隔的发育和表皮细胞的分化是由孢子细胞和绒毡层的分化引起的，之后是内皮层的分化。内皮层细胞进行选择性的次生增厚，而小室之间的隔膜和裂缝区域不增厚（Koltunowetal.,1990）。这说明内皮层的选择性次生增厚对于花药的开裂至关重要。花药开裂之前，隔膜经历细胞分裂和细胞编程性死亡（Marianaetal.,1990）。裂缝对花药开裂的重要性已经在番茄的细胞消融中得以证实（BealsandGoldberg,1997）。他们指出，裂缝特异性消融后会使花药开裂失败。双子叶模式植物拟南芥（Sandersetal.,1999）与茄科植物（BonnerandDickinson,1989；Sandersetal.,2005），单子叶植物水稻（Matsuietal.,1999）和玉米（Keijzeretal.,1996）的花药开裂过程相似，这说明控制花药开裂的相关基因在不同的物种中具有高度保守性。但是，不同物种之间的花药结构也存在着细小的差异，从而影响最终开裂的位置。由于不同物种花药结构存在细小差异，从形态和组织学特征方面，研究人员分析了30种茄科植物的花药开裂和裂缝结构，观察到三种主要的开裂机制：（a）孔裂，通过一个小的顶端孔开裂；（b）顶端口纵向开裂，有一个顶端孔，但开口继续向下纵向分
沈阳农业大学硕士学位论文21利用在线工具TMHMMServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白的跨膜结构；利用在线工具SignalPServer分析ZmNAC19和ZmNAC31蛋白质N端的信号肽。2.1.2.8玉米ZmNAC19和ZmNAC31蛋白质二级结构预测利用在线工具ProtParam、SOPMA和SWISSMODEL对ZmNAC19和ZmNAC31进行蛋白质一级、二级和三级结构预测。2.2结果与分析2.2.1玉米各组织总RNA的提取及花药、叶片高表达NAC基因的鉴定根据RNA提取试剂盒的说明书提取玉米拔节期的根、茎、叶，花丝，授粉前的雌穗，抽穗后的雄穗和形成期的种子的总RNA。结果如图2-1所示，可以清晰地看见28S和18S两条带，说明RNA提取成功。测定A260/A280后，发现所有样品RNA纯度都较好，可以用于下一步的反转录以及RT-PCR试验。图2-1玉米不同组织的总RNAFig.2-1TotalRNApreparationfromdifferenttissueofmaize注：Root：根；Stem：茎；Leaf：叶；Pistil：雌穗；Silk：花丝；Tassel：雄穗；Seed：种子因为Mitsuda等人（2007）在研究NST1和NST2基因时发现，这两个基因在调节叶片和花药的次生壁增厚过程中发挥重要功能，以及在水稻、小麦中也有研究表明NAC类基因调节植物叶片的衰老和花药开裂，因此，通过比对拟南芥长角果开裂相关基因NST的蛋白质序列，在玉米数据库中筛选出100个NAC类基因，结合相似性大小与转录组数据中叶和花药中的表达量多少，从初次筛选的100个基因中筛选出33个基因可能与花药的开裂、叶片的发育有关。为了检测该33个基因在玉米各个组织中的表达量，将RNA反转录成cDNA，再将筛选出的33个基因进行RT-PCR水平检测，33个基因在不同组织中的表达水平如表2-2所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]玉米花药发育的细胞生物学与分子遗传学的研究方法[J]. 田有辉,万向元. 中国生物工程杂志. 2018(01)
[2]‘粉红亚都蜜’葡萄NAC转录因子基因VvDRL1的功能初步分析[J]. 闫朝辉,李桂荣,穆金燕,娄航通,朱自果. 园艺学报. 2016(04)
[3]Cotton GhMYB7 is predominantly expressed in developing fibers and regulates secondary cell wall biosynthesis in transgenic Arabidopsis[J]. Junfeng Huang,Feng Chen,Siyu Wu,Juan Li,Wenliang Xu. Science China（Life Sciences）. 2016(02)
[4]非生物逆境相关基因在棉花抗逆研究中的进展[J]. 雷志,周美亮,吴燕民. 中国农业科技导报. 2014(02)
[5]植物NAC转录因子的研究进展[J]. 康桂娟,曾日中,聂智毅,黎瑜,代龙军,段翠芳. 生物技术通报. 2012(11)
[6]棉花叶片纤维素和木质素含量与绿盲蝽抗性的关系[J]. 雒珺瑜,崔金杰,辛惠江. 西北农林科技大学学报(自然科学版). 2012(04)
[7]Cytological analysis and genetic control of rice anther development[J]. Dabing Zhang~(a,b,*),Xue Luo~a,Lu Zhu~a a Institute of Plant Science,State Key Laboratory of Hybrid Rice,School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China b Bio-X Research Center,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China. 遗传学报. 2011(09)
[8]植物NAC转录因子的研究进展[J]. 冶晓芳,唐益苗,高世庆,杨颖,刘美英,王永波,赵昌平. 生物技术通报. 2009(10)
博士论文
[1]两个玉米近等基因系叶夹角差异的蛋白质组学研究[D]. 王宁.河南农业大学 2017
[2]鹰嘴豆NAC转录因子CarNAC4、CarNAC5和CarNAC2参与逆境胁迫响应的功能分析[D]. 于兴旺.南京农业大学 2014
[3]水稻抗逆转录因子SNAC1靶基因的分离和功能分析[D]. 游均.华中农业大学 2013
硕士论文
[1]玉米花分生组织基因ZmMADS35的功能浅析[D]. 赵若冰.沈阳农业大学 2019
[2]华中五味子不同时期木质素和木脂素含量变化及其合成关键酶CCR基因的研究[D]. 周势超.陕西师范大学 2018
[3]玉米干旱胁迫应答NAC基因的克隆及功能分析[D]. 张丽.西北农林科技大学 2017
[4]杨树PtoMYB170转录因子在次生壁合成调控及抗旱中的功能研究[D]. 刘瑞.西南大学 2016
[5]毛白杨MYB055转录因子在次生壁合成中的调控机制研究[D]. 叶胜龙.西南大学 2015
本文编号：3452489
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