油橄榄黄酮合成途径中三个关键酶基因的克隆及苯丙氨酸解氨酶基因的表达研究
发布时间：2021-10-25 06:56
油橄榄（Olea europaea L.）属于木犀科（Oleaceae）,是世界上一种重要的优质木本油料树种。油橄榄果实经压榨所得的橄榄油是目前世界上公认的最为健康的食用油,具有极佳的天然保健功效与美容功效,被誉为“液体黄金”、“植物油皇后”。油橄榄中富含的黄酮是一类多酚化合物,在植物生命活动中发挥着重要的生理功能,此外还可以作为药物具有多种药理作用,因此具有十分重要的开发潜力和研究价值。黄酮类化合物是植物苯丙烷代谢途径中的次生代谢物,苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase, PAL）、查尔酮合酶（chalcone synthase, CHS）和查尔酮异构酶（chalcone isomerase, CHI）是黄酮合成代谢途径中的三个关键酶,对植物中黄酮类物质的积累有重要的作用。本实验综合运用同源克隆、反转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）、融合引物嵌套PCR （fusion primer and nested integrated PCR, FPNI-PCR）...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 油橄榄概述
2 黄酮类化合物的研究进展
2.1 黄酮的种类和分布
2.2 油橄榄中的黄酮
2.3 黄酮的生物学功能
2.3.1 黄酮对植物的生理作用
2.3.2 黄酮的药理作用
2.4 黄酮的合成代谢途径
3 黄酮合成代谢途径中关键酶及其基因的研究进展
3.1 苯丙氨酸解氨酶及其基因的研究进展
3.2 查尔酮合酶及其基因的研究进展
3.3 查尔酮异构酶及其基因的研究进展
4 一种改进型染色体步移技术
5 研究的目的与意义
第二章 油橄榄PAL、CHS、CHI全长的克隆及序列分析
1 实验材料与仪器
1.1 油橄榄叶片
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂和溶液
1.4 菌株和培养基
2 方法
2.1 油橄榄基因组DNA的提取
2.2 油橄榄总RNA的提取及cDNA第一链制备
2.2.1 油橄榄叶片总RNA的提取
2.2.2 制备cDNA第一链
2.3 油橄榄PAL、CHS、CHI的克隆
2.3.1 PCR引物的设计
2.3.2 基因保守片段的克隆
2.3.3 基因5'端未知序列的克隆
2.3.4 基因3'端未知序列的克隆
2.3.5 基因全长的克隆
2.4 油橄榄PAL、CHS、CHI的生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 油橄榄叶片总DNA及总RNA的提取
3.2 油橄榄PAL的克隆及序列分析
3.2.1 油橄榄PAL的克隆
3.2.2 OePAL的核苷酸序列分析
3.2.3 OePAL的氨基酸序列分析
3.2.4 OePAL蛋白的结构预测
3.2.5 系统进化树的构建
3.3 油橄榄CHS的克隆及序列分析
3.3.1 油橄榄CHS的克隆
3.3.2 OeCHS的核苷酸序列分析
3.3.3 OeCHS的氨基酸序列分析
3.3.4 OeCHS蛋白的结构预测
3.3.5 系统进化树的构建
3.4 油橄榄CHI的克隆及序列分析
3.4.1 油橄榄CHI的克隆
3.4.2 OeCHI的核苷酸序列分析
3.4.3 OeCHI的氨基酸序列分析
3.4.4 OeCHI蛋白的结构预测
3.4.5 系统进化树的构建
4 讨论
4.1 OePAL、OeCHS、OeCHI的结构
4.2 CHS与CHI之间的关系
第三章 OePAL在毕赤酵母中的表达
1 实验材料和仪器
1.1 菌种和质粒
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂和溶液
1.4 培养基
2 实验方法
2.1 克隆OePAL的目的序列
2.2 表达载体的构建
2.2.1 酶切及回收
2.2.2 目的片段与表达载体的连接
2.2.3 转化筛选与鉴定
2.2.4 pPICZαA-OePAL的线性化
2.3 表达载体转化毕赤酵母X33
2.3.1 毕赤酵母X33感受态的制备
2.3.2 电击转化毕赤酵母X33感受态细胞
2.3.3 重组酵母阳性转化子的筛选
2.4 重组酵母的诱导表达及表达产物的纯化、检测
2.4.1 重组酵母的诱导表达
2.4.2 重组酶的分离纯化
2.4.3 重组酶的SDS-PAGE检测
2.5 蛋白质含量的测定
2.5.1 低浓度蛋白标准曲线的绘制
2.5.2 酶液中蛋白含量的测定
2.6 重组6×His-OePAL酶活性的测定
2.7 重组6×His-OePAL酶学性质研究
2.7.1 温度对重组酶活力的影响
2.7.2 pH值对重组酶活力的影响
2.7.3 金属离子对重组酶活力的影响
2.7.4 重组酶反应动力学常数K_m的测定
3 结果与分析
3.1 OePAL目的序列的克隆
3.2 重组质粒pPICZαA-OePAL的鉴定
3.3 毕赤酵母X33/pPICZαA-OePAL阳性转化子的菌落PCR鉴定
3.4 表达产物的SDS-PAGE检测
3.5 重组酶的比活力测定
3.5.1 蛋白含量测定的标准曲线绘制
3.5.2 计算重组酶的比活力
3.6 重组酶的酶学性质分析
3.6.1 温度对重组酶活力的影响
3.6.2 pH值对重组酶活力的影响
3.6.3 金属离子对重组酶活力的影响
3.6.4 重组酶反应动力学常数K_m的测定
4 讨论
4.1 表达宿主菌及载体的选用
4.2 重组质粒pPICZαA-OePAL的构建
4.3 重组OePAL的活性及酶学性质分析
全文总结
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 张健慧,王首锋. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2014(01)
[2]红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因pal在大肠杆菌中的克隆与表达[J]. 侯文婷,张梁,顾正华,丁重阳,石贵阳. 生物加工过程. 2012(05)
[3]四川省油橄榄引种品种果实含油率及其脂肪酸分析[J]. 朱万泽,范建容,彭建国,杨洪彬,杨本年,何明波. 林业科学. 2010(08)
[4]转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响[J]. 夏玉凤,耿晓娜,王万双,赵宝华. 生物技术通报. 2010(01)
[5]三种油橄榄叶片中多酚含量的季节动态变化研究[J]. 梁剑. 北方园艺. 2010(01)
[6]百合鳞茎苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 孙红梅,赵爽,王春夏,王锦霞,赵波,陈丽静. 园艺学报. 2008(11)
[7]银杏查尔酮合成酶基因表达的时间进程(英文)[J]. 许锋,程水源,程述汉,王燕,杜何为. 植物生理与分子生物学学报. 2007(04)
[8]山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究[J]. 江力,袁怀波,张世杰,江汉湖. 食品科学. 2006(10)
[9]油橄榄叶中多酚和黄酮的含量分析[J]. 高彩霞,王成章,陈文英,姜成英,戚登臣. 生物质化学工程. 2006(04)
[10]大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定[J]. 宋柬,马会勤,郝佳,任发政,陈尚武. 食品科学. 2006(07)
硕士论文
[1]盐肤木苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其功能性质研究[D]. 武敏.山西大学 2012
[2]芸薹属查尔酮异构酶基因家族的克隆与功能鉴定[D]. 曹廷.西南大学 2011
[3]国产油橄榄叶中酚类化合物的分析与表征[D]. 王百川.大连工业大学 2011
[4]大豆黄酮及半胱胺对鹅脂肪代谢的影响[D]. 马海田.东北农业大学 2002
本文编号：3456878
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：73 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 油橄榄概述
2 黄酮类化合物的研究进展
2.1 黄酮的种类和分布
2.2 油橄榄中的黄酮
2.3 黄酮的生物学功能
2.3.1 黄酮对植物的生理作用
2.3.2 黄酮的药理作用
2.4 黄酮的合成代谢途径
3 黄酮合成代谢途径中关键酶及其基因的研究进展
3.1 苯丙氨酸解氨酶及其基因的研究进展
3.2 查尔酮合酶及其基因的研究进展
3.3 查尔酮异构酶及其基因的研究进展
4 一种改进型染色体步移技术
5 研究的目的与意义
第二章 油橄榄PAL、CHS、CHI全长的克隆及序列分析
1 实验材料与仪器
1.1 油橄榄叶片
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂和溶液
1.4 菌株和培养基
2 方法
2.1 油橄榄基因组DNA的提取
2.2 油橄榄总RNA的提取及cDNA第一链制备
2.2.1 油橄榄叶片总RNA的提取
2.2.2 制备cDNA第一链
2.3 油橄榄PAL、CHS、CHI的克隆
2.3.1 PCR引物的设计
2.3.2 基因保守片段的克隆
2.3.3 基因5'端未知序列的克隆
2.3.4 基因3'端未知序列的克隆
2.3.5 基因全长的克隆
2.4 油橄榄PAL、CHS、CHI的生物信息学分析
3 结果与分析
3.1 油橄榄叶片总DNA及总RNA的提取
3.2 油橄榄PAL的克隆及序列分析
3.2.1 油橄榄PAL的克隆
3.2.2 OePAL的核苷酸序列分析
3.2.3 OePAL的氨基酸序列分析
3.2.4 OePAL蛋白的结构预测
3.2.5 系统进化树的构建
3.3 油橄榄CHS的克隆及序列分析
3.3.1 油橄榄CHS的克隆
3.3.2 OeCHS的核苷酸序列分析
3.3.3 OeCHS的氨基酸序列分析
3.3.4 OeCHS蛋白的结构预测
3.3.5 系统进化树的构建
3.4 油橄榄CHI的克隆及序列分析
3.4.1 油橄榄CHI的克隆
3.4.2 OeCHI的核苷酸序列分析
3.4.3 OeCHI的氨基酸序列分析
3.4.4 OeCHI蛋白的结构预测
3.4.5 系统进化树的构建
4 讨论
4.1 OePAL、OeCHS、OeCHI的结构
4.2 CHS与CHI之间的关系
第三章 OePAL在毕赤酵母中的表达
1 实验材料和仪器
1.1 菌种和质粒
1.2 主要仪器设备
1.3 主要试剂和溶液
1.4 培养基
2 实验方法
2.1 克隆OePAL的目的序列
2.2 表达载体的构建
2.2.1 酶切及回收
2.2.2 目的片段与表达载体的连接
2.2.3 转化筛选与鉴定
2.2.4 pPICZαA-OePAL的线性化
2.3 表达载体转化毕赤酵母X33
2.3.1 毕赤酵母X33感受态的制备
2.3.2 电击转化毕赤酵母X33感受态细胞
2.3.3 重组酵母阳性转化子的筛选
2.4 重组酵母的诱导表达及表达产物的纯化、检测
2.4.1 重组酵母的诱导表达
2.4.2 重组酶的分离纯化
2.4.3 重组酶的SDS-PAGE检测
2.5 蛋白质含量的测定
2.5.1 低浓度蛋白标准曲线的绘制
2.5.2 酶液中蛋白含量的测定
2.6 重组6×His-OePAL酶活性的测定
2.7 重组6×His-OePAL酶学性质研究
2.7.1 温度对重组酶活力的影响
2.7.2 pH值对重组酶活力的影响
2.7.3 金属离子对重组酶活力的影响
2.7.4 重组酶反应动力学常数K_m的测定
3 结果与分析
3.1 OePAL目的序列的克隆
3.2 重组质粒pPICZαA-OePAL的鉴定
3.3 毕赤酵母X33/pPICZαA-OePAL阳性转化子的菌落PCR鉴定
3.4 表达产物的SDS-PAGE检测
3.5 重组酶的比活力测定
3.5.1 蛋白含量测定的标准曲线绘制
3.5.2 计算重组酶的比活力
3.6 重组酶的酶学性质分析
3.6.1 温度对重组酶活力的影响
3.6.2 pH值对重组酶活力的影响
3.6.3 金属离子对重组酶活力的影响
3.6.4 重组酶反应动力学常数K_m的测定
4 讨论
4.1 表达宿主菌及载体的选用
4.2 重组质粒pPICZαA-OePAL的构建
4.3 重组OePAL的活性及酶学性质分析
全文总结
参考文献
攻读硕士学位期间发表的论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]膜荚黄芪苯丙氨酸解氨酶基因在毕赤酵母中的分泌表达[J]. 张健慧,王首锋. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2014(01)
[2]红冬孢酵母苯丙氨酸解氨酶基因pal在大肠杆菌中的克隆与表达[J]. 侯文婷,张梁,顾正华,丁重阳,石贵阳. 生物加工过程. 2012(05)
[3]四川省油橄榄引种品种果实含油率及其脂肪酸分析[J]. 朱万泽,范建容,彭建国,杨洪彬,杨本年,何明波. 林业科学. 2010(08)
[4]转查尔酮合酶基因对烟草花色及花器官的影响[J]. 夏玉凤,耿晓娜,王万双,赵宝华. 生物技术通报. 2010(01)
[5]三种油橄榄叶片中多酚含量的季节动态变化研究[J]. 梁剑. 北方园艺. 2010(01)
[6]百合鳞茎苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及酶学性质研究[J]. 孙红梅,赵爽,王春夏,王锦霞,赵波,陈丽静. 园艺学报. 2008(11)
[7]银杏查尔酮合成酶基因表达的时间进程(英文)[J]. 许锋,程水源,程述汉,王燕,杜何为. 植物生理与分子生物学学报. 2007(04)
[8]山药苯丙氨酸解氨酶特性的研究[J]. 江力,袁怀波,张世杰,江汉湖. 食品科学. 2006(10)
[9]油橄榄叶中多酚和黄酮的含量分析[J]. 高彩霞,王成章,陈文英,姜成英,戚登臣. 生物质化学工程. 2006(04)
[10]大豆苯丙氨酸解氨酶（PAL）在大肠杆菌中的重组表达及活性鉴定[J]. 宋柬,马会勤,郝佳,任发政,陈尚武. 食品科学. 2006(07)
硕士论文
[1]盐肤木苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及其功能性质研究[D]. 武敏.山西大学 2012
[2]芸薹属查尔酮异构酶基因家族的克隆与功能鉴定[D]. 曹廷.西南大学 2011
[3]国产油橄榄叶中酚类化合物的分析与表征[D]. 王百川.大连工业大学 2011
[4]大豆黄酮及半胱胺对鹅脂肪代谢的影响[D]. 马海田.东北农业大学 2002
本文编号：3456878
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