猪传染性胃肠炎病毒HB-FP株的分离鉴定及自噬对其增殖的影响
发布时间：2021-10-26 01:21
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由冠状病毒科冠状病毒属成员猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。该病的主要临床特征为严重腹泻、脱水及迅速消瘦,2周龄以下仔猪死亡率可达100%,给养猪业带来了严重的经济损失。目前,TGE主要通过接种疫苗来进行预防控制,但是近年来流行的病毒处在一个毒力和生物学特性不断变异的动态过程中,传统疫苗已经达不到抵抗自然流行毒株的效果。本研究对我国河北地区的TGEV流行毒株进行了分离鉴定,并获得一株稳定的细胞传代毒株;对该分离毒株S、M基因进行了遗传进化分析,并探究了细胞自噬对该TGEV流行株复制的影响。本研究成果不仅为TGEV流行毒株致病机理等提供重要的理论基础而且对新型疫苗的研发上具有重要意义。本研究从河北某地采集临床表现为腹泻的仔猪粪便及小肠内容物,RT-PCR检测为TGEV阳性的病料处理后接种到PK-15细胞上进行传代,在盲传至第5代时出现典型的细胞病变。经RT-PCR检测,细胞培养物为TGEV 阳性,P...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＴＧＥＶ病毒粒子示意图［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｖｉｒｕｓ?ｐａｒｔｉｃｌｅｓ??
的影响???３结果与分析??３．１病料的检测结果??将实验室收集的２０１７年９月？２０１８年９月年河北不同猪场４２份腹泻疑似病料研磨后离心，??得到上清液分别使用ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特异性引物分别进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，检测结??果显示，４．８％?（２／４２）为?ＴＧＥＶ?阳性，４．８％?（２／４２）?ＰＤＣｏＶ?为阳性，５２．４％?（２２／４２）?ＰＥＤＶ?为阳??性，２．４％?（１／４２）?ＰＲＶ为阳性。琼脂糖凝胶检测结果显示只有一份病料为ＴＧＥＶ单一感染（图２），??ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特异性引物未扩增出目的基因。将目的片段胶回收后连接转化，菌液测序??后结果显示该片段为ＴＧＥＶ?Ｍ基因。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?■??１０００?Ｈ??７５０??５０。??２５０??１００?Ｉ??图２病料ＰＣＲ扩增结果??Ｆｉｇ．２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｅｃｅｓ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ?分子标准量；１：阴性对照；２：?ＴＧＥＶ?ＰＣＲ?结果；３：?ＰＥＤＶ?ＰＣＲ?结果；４：?ＰＤＣｏＶ?ＰＣＲ?结果；５：??ＰＲＶ?ＰＣＲ?结果；??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．?Ｌａｎｅ?２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＴＧＥＶ；３：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＥＤＶ；２：??ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＤＣｏＶ；２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＲＶ；??３．２病毒的分离鉴定??３．２．１细胞病变鉴定??将ＲＴ－ＰＣＲ鉴定为ＴＧＥＶ阳性，ＰＥＤＶ、ＰＤＣｏＶ
ａｔ?１０ｔｈ?ｐａｓｓａｇｅ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ?（１０〇ｘ）??Ａ．未感染病毒的ＰＫ－１５细胞Ｂ．感染病毒３６ｈ后的ＰＫ－１５细胞??Ａ．?Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?Ｂ．?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｖｉｒｕｓ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ??３．２．２细胞毒ＲＴ－ＰＣＲ鉴定??将Ｆ１０代细胞毒培养物和对照组细胞上清提取ＲＮＡ，?ＲＴ－ＰＣＲ扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，??结果显示，Ｆ１０代细胞毒扩增出与预期扩增片段大小（３９６ｂｐ）?—致的片段（图４），而ＰＥＤＶ、??ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ检测结果均为阴性。对照组细胞所有病毒检测均为阴性。可以证明本试验细胞分离??的病毒为ＴＧＥＶ，命名为ＴＧＥＶＨＢ－ＦＰ株。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＩＩ—??２０００??１０００??７５０??■??２５０??屬??图４?ＴＧＥＶ分离株ＨＢ－ＦＰＭ基因片段ＰＣＲ产物??Ｆｉｇ．４?ＲＴ－ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｉｓｏｌａｔｅ?ＨＢ－ＦＰ?Ｍ?ｇｅｎｅ?ｆｒａｇｅｎｔ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ分子标准量；１：第１０代细胞培养物ＰＣＲ结果；２：阴性对照??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｔｈｅ?ｔｅｎｔｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｃｕｌｔｕｒｅ，?Ｌａｎｅ?２：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[J]. 李晓楠,唐青海,李羽,王瑾,姚伦广,阚云超,杨海. 河南农业科学. 2017(08)
[2]猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用[J]. 罗亚坤,梁琳,王静,刘存,刘琪,刘畅,蔺文成,崔尚金. 中国畜牧兽医. 2017(02)
[3]猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 熊年年,陶洁,张清真,张春玲,李本强,常宏赏,刘惠莉. 中国兽医科学. 2016(08)
[4]猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其S基因分子生物学特征的分析[J]. 白云云,葛旭影,高睿泽,李训良,任玉东,任晓峰,李广兴,宋铭忻. 中国兽医科学. 2016(03)
[5]猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因进化分析[J]. 孙秋艳,郭洪梅,沈美艳,王志远. 动物医学进展. 2015(07)
[6]猪传染性胃肠炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用[J]. 高睿泽,白云云,李训良,任玉东,任晓峰,李广兴,路义鑫. 中国兽医科学. 2015(06)
[7]鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 刘琪,冯晓声,周如月,贾爱卿,王贵平. 广东畜牧兽医科技. 2015(02)
[8]猪传染性胃肠炎的正确诊断及防治[J]. 张雷. 畜牧兽医科技信息. 2013(10)
[9]细胞自噬与病毒感染[J]. 陶冶,任晓峰. 病毒学报. 2013(01)
[10]猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）福建分离株核衣壳蛋白基因（N）的克隆与表达分析[J]. 王劭,朱小丽,朱晓琳,陈少莺,林锋强,陈仕龙,程晓霞,李兆龙,江斌. 农业生物技术学报. 2013(01)
博士论文
[1]猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞自噬机制研究[D]. 朱炳林.浙江大学 2012
[2]猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究[D]. 兰喜.中国农业科学院 2006
硕士论文
[1]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用[D]. 罗尚星.河北农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖.黑龙江八一农垦大学 2017
[4]猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价[D]. 苏明俊.黑龙江八一农垦大学 2017
[5]猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立与应用[D]. 徐向伟.南京农业大学 2016
[6]猪传染性胃肠炎病毒分离及部分特性鉴定[D]. 徐静.东北农业大学 2015
[7]猪传染性胃肠炎病毒N基因的荧光定量PCR检测方法建立及初步应用[D]. 李蕊彤.四川农业大学 2015
[8]猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 裴丽华.河北农业大学 2014
[9]猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离及鉴定[D]. 姜春霞.东北农业大学 2013
[10]传染性胰腺坏死病毒VP2抗原表位区间接免疫荧光方法的建立[D]. 王健楠.东北农业大学 2012
本文编号：3458544
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１?ＴＧＥＶ病毒粒子示意图［１３］??Ｆｉｇ．?１?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｖｉｒｕｓ?ｐａｒｔｉｃｌｅｓ??
的影响???３结果与分析??３．１病料的检测结果??将实验室收集的２０１７年９月？２０１８年９月年河北不同猪场４２份腹泻疑似病料研磨后离心，??得到上清液分别使用ＴＧＥＶ、ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特异性引物分别进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，检测结??果显示，４．８％?（２／４２）为?ＴＧＥＶ?阳性，４．８％?（２／４２）?ＰＤＣｏＶ?为阳性，５２．４％?（２２／４２）?ＰＥＤＶ?为阳??性，２．４％?（１／４２）?ＰＲＶ为阳性。琼脂糖凝胶检测结果显示只有一份病料为ＴＧＥＶ单一感染（图２），??ＰＥＤＶ、ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ特异性引物未扩增出目的基因。将目的片段胶回收后连接转化，菌液测序??后结果显示该片段为ＴＧＥＶ?Ｍ基因。??ｂｐ?Ｍ?１?２?３?４?５??２０００?■??１０００?Ｈ??７５０??５０。??２５０??１００?Ｉ??图２病料ＰＣＲ扩增结果??Ｆｉｇ．２?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｅｃｅｓ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ?分子标准量；１：阴性对照；２：?ＴＧＥＶ?ＰＣＲ?结果；３：?ＰＥＤＶ?ＰＣＲ?结果；４：?ＰＤＣｏＶ?ＰＣＲ?结果；５：??ＰＲＶ?ＰＣＲ?结果；??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．?Ｌａｎｅ?２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＴＧＥＶ；３：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＥＤＶ；２：??ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＤＣｏＶ；２：?ＰＣＲ?Ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ＰＲＶ；??３．２病毒的分离鉴定??３．２．１细胞病变鉴定??将ＲＴ－ＰＣＲ鉴定为ＴＧＥＶ阳性，ＰＥＤＶ、ＰＤＣｏＶ
ａｔ?１０ｔｈ?ｐａｓｓａｇｅ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ?（１０〇ｘ）??Ａ．未感染病毒的ＰＫ－１５细胞Ｂ．感染病毒３６ｈ后的ＰＫ－１５细胞??Ａ．?Ｎｏｎ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?Ｂ．?ＰＫ－１５?ｃｅｌｌｓ?ｉｎｆｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ｖｉｒｕｓ?ａｆｔｅｒ?３６ｈ??３．２．２细胞毒ＲＴ－ＰＣＲ鉴定??将Ｆ１０代细胞毒培养物和对照组细胞上清提取ＲＮＡ，?ＲＴ－ＰＣＲ扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，??结果显示，Ｆ１０代细胞毒扩增出与预期扩增片段大小（３９６ｂｐ）?—致的片段（图４），而ＰＥＤＶ、??ＰＲＶ、ＰＤＣｏＶ检测结果均为阴性。对照组细胞所有病毒检测均为阴性。可以证明本试验细胞分离??的病毒为ＴＧＥＶ，命名为ＴＧＥＶＨＢ－ＦＰ株。??ｂｐ?Ｍ?１?２??ＩＩ—??２０００??１０００??７５０??■??２５０??屬??图４?ＴＧＥＶ分离株ＨＢ－ＦＰＭ基因片段ＰＣＲ产物??Ｆｉｇ．４?ＲＴ－ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔ?ｏｆ?ＴＧＥＶ?ｉｓｏｌａｔｅ?ＨＢ－ＦＰ?Ｍ?ｇｅｎｅ?ｆｒａｇｅｎｔ??Ｍ：?２０００?ＤＮＡ分子标准量；１：第１０代细胞培养物ＰＣＲ结果；２：阴性对照??Ｌａｎｅ?Ｍ：?ＤＬ２０００?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ，?Ｌａｎｅ?１：?ｔｈｅ?ｔｅｎｔｈ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｃｅｌｌ?ｃｕｌｔｕｒｅ，?Ｌａｎｅ?２：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ??２４??
【参考文献】：
期刊论文
[1]1株猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其生物学特性研究[J]. 李晓楠,唐青海,李羽,王瑾,姚伦广,阚云超,杨海. 河南农业科学. 2017(08)
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[3]猪四种病毒性腹泻病原多重PCR检测方法的建立及应用[J]. 熊年年,陶洁,张清真,张春玲,李本强,常宏赏,刘惠莉. 中国兽医科学. 2016(08)
[4]猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及其S基因分子生物学特征的分析[J]. 白云云,葛旭影,高睿泽,李训良,任玉东,任晓峰,李广兴,宋铭忻. 中国兽医科学. 2016(03)
[5]猪传染性胃肠炎病毒的分离鉴定及S基因进化分析[J]. 孙秋艳,郭洪梅,沈美艳,王志远. 动物医学进展. 2015(07)
[6]猪传染性胃肠炎病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用[J]. 高睿泽,白云云,李训良,任玉东,任晓峰,李广兴,路义鑫. 中国兽医科学. 2015(06)
[7]鉴别猪流行性腹泻疫苗毒株与野毒株巢式PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 刘琪,冯晓声,周如月,贾爱卿,王贵平. 广东畜牧兽医科技. 2015(02)
[8]猪传染性胃肠炎的正确诊断及防治[J]. 张雷. 畜牧兽医科技信息. 2013(10)
[9]细胞自噬与病毒感染[J]. 陶冶,任晓峰. 病毒学报. 2013(01)
[10]猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）福建分离株核衣壳蛋白基因（N）的克隆与表达分析[J]. 王劭,朱小丽,朱晓琳,陈少莺,林锋强,陈仕龙,程晓霞,李兆龙,江斌. 农业生物技术学报. 2013(01)
博士论文
[1]猪圆环病毒2型感染诱导PK-15细胞自噬机制研究[D]. 朱炳林.浙江大学 2012
[2]猪传染性胃肠炎病毒的分子诊断与免疫研究[D]. 兰喜.中国农业科学院 2006
硕士论文
[1]猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用[D]. 罗尚星.河北农业大学 2018
[2]猪丁型冠状病毒HB-BD株分离鉴定及生物学特性研究[D]. 刘宝京.河北农业大学 2018
[3]猪传染性胃肠炎流行毒株的分离鉴定及全基因组分析[D]. 朱蕴暖.黑龙江八一农垦大学 2017
[4]猪δ冠状病毒重组N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与评价[D]. 苏明俊.黑龙江八一农垦大学 2017
[5]猪传染性胃肠炎病毒N蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立与应用[D]. 徐向伟.南京农业大学 2016
[6]猪传染性胃肠炎病毒分离及部分特性鉴定[D]. 徐静.东北农业大学 2015
[7]猪传染性胃肠炎病毒N基因的荧光定量PCR检测方法建立及初步应用[D]. 李蕊彤.四川农业大学 2015
[8]猪伪狂犬病毒gE基因亚克隆、原核表达及ELISA抗体检测方法的建立[D]. 裴丽华.河北农业大学 2014
[9]猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离及鉴定[D]. 姜春霞.东北农业大学 2013
[10]传染性胰腺坏死病毒VP2抗原表位区间接免疫荧光方法的建立[D]. 王健楠.东北农业大学 2012
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