拟南芥蓝光受体CRY2与LWDs互作对CCA1基因表达的调控分析
发布时间：2021-12-11 09:13
生物钟是植物细胞内部的授时机制,主要包括输入途径、核心振荡器和信号输出途径。在外界环境因子（主要是光照和温度）的刺激下其内部授时机制发生大约以24h为周期的振荡态节律。该系统在协调植物生长发育、代谢与生理反应等方面具有重要意义,赋予了植物对生存环境的适应性。植物生物钟系统的核心振荡器通过多层级调控复杂的信号反馈调节网络来参与调节植物生长发育及对生物与非生物胁迫的适应性。CCA1是人们鉴定到的第一个生物钟核心振荡器基因,进一步的实验结果证明在过表达CCA1的情况下拟南芥表现出晚花并抑制内源CCA1的表达。据此,拟南芥体内生物钟的第一个反馈调节信号通路机制得到证实:在清晨CCA1/LHY对TOC1的表达具有抑制作用,而在夜间TOC1对CCA1/LHY的表达也具有抑制作用,这奠定人们对研究植物生物钟的转录-翻译反馈系统的基础。然而,拟南芥蓝光受体隐花色素2（Cryptochrome2,CRY2）对于植物生物钟的调控的研究尚不明确。LWDs可通过结合于CCA1启动子上的方式来调控CCA1的表达从而促进植物生物钟的震荡。因此我们进一步研究了LWDs对CCA1的调控是否依赖于CRY2。具体研究结果...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生物钟反馈调节网络模型
第2章CRY2与LWDs相互作用验证30（4）分装上清到1.5mL离心管中，12000rpm离心20min。（5）重复过程（2）两次，确保没有杂质。（6）吸出30μL作为Input。（7）Biotion-Beads用1mLNEBwashbuffer洗三次。（7）剩余样品与Biotion-Beads完全混合，垂直混匀中孵育2h。（8）弃上清后，1mLNEBwashbuffer洗三次。（9）弃上清，保留Beads与Input内加入适量的4*Samplebuffer，金属浴100℃10min，备用。注：Beads相关清洗均为800g、5min。2.3.9.3WesternBlot具体步骤参照2.3.8.5。2.4结果与分析2.4.1载体构建结果哥伦比亚生态型拟南芥(Col4)的cDNA作为模板，通过PCR扩增的方法得到LWD1/LWD2基因，电泳结果如图2.1（A）；限制性内切酶线性化pGADT7载体的具体结果如图2.1（B）；链接转化后的菌液PCR具体结果如图2.1（C）。abc图2.1pGADT7-LWD1载体的构建Fig.2.1ConstructionofpGADT7-LWD1Vector
第2章CRY2与LWDs相互作用验证312.4.2组氨酸营养缺陷型实验及液体显色验证CYR2与LWD1的互作2.4.2.1组氨酸缺陷实验验证构建好pGADT7-LWD1后，利用酵母双杂交试验方法初步验证CRY2和LWDs的互作以及该互作是否是否受蓝光诱导。本实验将pGADT7-LWDs与pBridge-CRY2、pGADT7-LWD1与BD-Vector共转入Y2HGold酵母感受态细胞中，pGADT7-LWD1与BD-Vector作为阴性对照，分别点斑在SD/-Trp-Leu二缺缺素培养基平板上和SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培养基平板上。实验过程中将所有实验组分为两份，一份用30μmol·m2·s1的蓝光诱导，另一份进行避光处理后放置于相同环境条件，放入30℃恒温培养箱3~4天后观察拍照。无论哪种组合在SD/-Trp-Leu二缺平板上的都可以正常生长（如图2.2所示），证明酵母转化步骤正常；而SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培养基平板上可以观察到仅有放在蓝光下的pGADT7-LWD1与pBridge-CRY2、pGADT7-LWD2与pBridge-CRY2这两组组合正常生长，阴性对照不生长或生长非常弱，说明了CRY2和LWDs可以在酵母细胞内互作，并且他们的互作依赖蓝光。同时我们发现LWD2生长情况要比LWD1更好，这有可能是LWD2和CRY2在蓝光下互作更强导致。图2.2组氨酸营养缺陷型实验展示LWDs和CRY2的互作Fig.2.2HistidineauxotrophicexperimentdemonstratesinteractionofLWDsandCRY2
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物生物钟研究的历史回顾与最新进展[J]. 徐小冬,谢启光. 自然杂志. 2013(02)
本文编号：3534408
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
生物钟反馈调节网络模型
第2章CRY2与LWDs相互作用验证30（4）分装上清到1.5mL离心管中，12000rpm离心20min。（5）重复过程（2）两次，确保没有杂质。（6）吸出30μL作为Input。（7）Biotion-Beads用1mLNEBwashbuffer洗三次。（7）剩余样品与Biotion-Beads完全混合，垂直混匀中孵育2h。（8）弃上清后，1mLNEBwashbuffer洗三次。（9）弃上清，保留Beads与Input内加入适量的4*Samplebuffer，金属浴100℃10min，备用。注：Beads相关清洗均为800g、5min。2.3.9.3WesternBlot具体步骤参照2.3.8.5。2.4结果与分析2.4.1载体构建结果哥伦比亚生态型拟南芥(Col4)的cDNA作为模板，通过PCR扩增的方法得到LWD1/LWD2基因，电泳结果如图2.1（A）；限制性内切酶线性化pGADT7载体的具体结果如图2.1（B）；链接转化后的菌液PCR具体结果如图2.1（C）。abc图2.1pGADT7-LWD1载体的构建Fig.2.1ConstructionofpGADT7-LWD1Vector
第2章CRY2与LWDs相互作用验证312.4.2组氨酸营养缺陷型实验及液体显色验证CYR2与LWD1的互作2.4.2.1组氨酸缺陷实验验证构建好pGADT7-LWD1后，利用酵母双杂交试验方法初步验证CRY2和LWDs的互作以及该互作是否是否受蓝光诱导。本实验将pGADT7-LWDs与pBridge-CRY2、pGADT7-LWD1与BD-Vector共转入Y2HGold酵母感受态细胞中，pGADT7-LWD1与BD-Vector作为阴性对照，分别点斑在SD/-Trp-Leu二缺缺素培养基平板上和SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培养基平板上。实验过程中将所有实验组分为两份，一份用30μmol·m2·s1的蓝光诱导，另一份进行避光处理后放置于相同环境条件，放入30℃恒温培养箱3~4天后观察拍照。无论哪种组合在SD/-Trp-Leu二缺平板上的都可以正常生长（如图2.2所示），证明酵母转化步骤正常；而SD/-Trp-Leu-His三缺缺素培养基平板上可以观察到仅有放在蓝光下的pGADT7-LWD1与pBridge-CRY2、pGADT7-LWD2与pBridge-CRY2这两组组合正常生长，阴性对照不生长或生长非常弱，说明了CRY2和LWDs可以在酵母细胞内互作，并且他们的互作依赖蓝光。同时我们发现LWD2生长情况要比LWD1更好，这有可能是LWD2和CRY2在蓝光下互作更强导致。图2.2组氨酸营养缺陷型实验展示LWDs和CRY2的互作Fig.2.2HistidineauxotrophicexperimentdemonstratesinteractionofLWDsandCRY2
【参考文献】：
期刊论文
[1]植物生物钟研究的历史回顾与最新进展[J]. 徐小冬,谢启光. 自然杂志. 2013(02)
本文编号：3534408
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