基于噻唑橙和聚苯胺的DNA甲基化检测方法研究
本文关键词：基于噻唑橙和聚苯胺的DNA甲基化检测方法研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式,在甲基转移酶的催化作用下,将甲基自由基选择性地添加到DNA的CpG序列的胞嘧啶上,从而形成5-甲基胞嘧啶,通常发生在基因的5'-CG-3'序列(被称为CpG岛)。大量的科学研究表明,DNA甲基化涉及到很多细胞的调控过程,例如调控基因表达、胚胎发育、抑制转录、染色质结构、X-染色体失活、染色体结构重组、基因组印迹和染色体的稳定性。在高等真核生物的正常细胞中,一般情况下CpG岛是末甲基化,但是,异常甲基化会抑制遗传信息的表达,会导致人类各种疾病,比如癌症的发生。因此,DNA甲基化可以作为疾病的一种潜在生物标志。同时,甲基转移酶在细胞分化和发育、基因的抑制、肿瘤和基因疾病中发挥了关键作用,所以甲基转移酶的活性评价在药物研发和临床诊断的领域很重要。因此,发展一种迅速、简单、高效、选择性高的DNA甲基化和甲基转移酶活性的检测方法是刻不容缓的。本论文围绕DNA甲基化和DNA甲基转移酶的检测开展了如下两个工作：第一,我们发展了一种基于限制性内切酶HpaⅡ和外切酶III(Exo III)的无标记荧光检测DNA甲基化和DNA甲基转移酶活性的方法。设计了一种可与目标DNA杂交形成双链DNA的无标记探针DNA。我们以从人p53基因外显子8上截取了一段32碱基长度的DNA作为研究对象。由于HpaⅡ切割和ExoⅢ消化的作用,双链DNA会变成单链DNA,导致噻唑橙的荧光强度减弱。但是,在双链DNA上特定的序列被DNA甲基转移酶甲基化后,就会抑制Jpan和Exo Ⅲ的功能,噻唑橙嵌入到双链DNA中,从而发出很强的荧光。这种方法可以确定DNA上特定位点CpG的甲基化,同时我们进一步考察了由化学试剂二甲亚砜(DMSO)和乙醛(CH3CH0)引起的甲基化。对人血清样品的分析,表明此方法在进一步应用到复杂的生物胖品中有着巨大的潜力。第二,发展了一种基于限制性内切酶HpaⅡ和HRP模拟酶(bemin/G-quadruplex DNAzyme)诱导聚苯胺合成的甲基转移酶活性检测方法。其中HRP模拟酶作为一种强催化剂,催化双氧水诱导苯胺在电极表面的DNA上聚合生成聚苯胺(PANI),进而聚苯胺作为本实验中的氧化还原信号分子。电极表面先修饰捕获探针(S1),然后与目标DNA (S2)杂交形成双链DNA。在没有甲基转移酶存在的情况下,双链DNA就会被HpaⅡⅡ切割,那么DANzyme DNA (S3)就不能与电极上的DNA杂交,继而HRP模拟酶也就不会形成。苯胺不能在电极表面聚合,就不会有电流信号。但是,在甲基转移酶存在的情况下,双链DNA会被甲基化,就会抑制HpaⅡ的切割功能。HRP模拟酶顺利在电极表面形成,催化H2O2诱导苯胺聚合。由于聚苯胺的生成,就会有强的电流信号。这种方法可以准确地检测特定位点CpG的甲基化。同时也对人血清中检测DNA甲基转移酶活性的效果进行了验证。另外,我们还研究这种方法在甲基转移酶抑制剂筛选中的应用。
【关键词】：DNA甲基化 甲基转移酶 限制性内切酶 噻唑橙 聚苯胺 荧光检测 电化学检测
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q78
【目录】：
- 摘要4-5
- Abstract5-9
- 第一章 绪论9-18
- 1.1 DNA甲基化概述9-11
- 1.1.1 CpG岛9-10
- 1.1.2 DNA甲基化的生成10
- 1.1.3 DNA甲基化与肿瘤10-11
- 1.2 影响DNA甲基化的因素11-14
- 1.2.1 DNA甲基转移酶11-12
- 1.2.2 组蛋白甲基化12
- 1.2.3 饮食等环境因素12-13
- 1.2.4 RNA干扰13-14
- 1.2.5 病毒感染14
- 1.3 DNA甲基化的检测方法14-17
- 1.3.1 重亚硫酸盐测序法14-15
- 1.3.2 高效液相色谱15
- 1.3.3 高效毛细管电泳法15
- 1.3.4 甲基化敏感性限制内切酶法15-16
- 1.3.5 甲基化结合蛋白分析方法16-17
- 1.4 本文研究的内容17-18
- 第二章 基于限制性内切酶和外切酶Ⅲ的无标记荧光检测DNA甲基化和甲基转移酶活性18-29
- 2.1 引言18-20
- 2.2 实验部分20-21
- 2.2.1 试剂和仪器20
- 2.2.2 探针DNA与目标DNA杂交20
- 2.2.3 DNA甲基化及限制性内切酶和外切酶Ⅲ的作用20-21
- 2.2.4 由化学试剂引起的DNA甲基化21
- 2.2.5 在血清中检测M.SssI甲基转移酶活性21
- 2.3 结果与讨论21-28
- 2.3.1 噻唑橙的荧光性能和它的浓度优化21-22
- 2.3.2 HpaⅡ和ExoⅢ的功能验证及它们的浓度优化22-23
- 2.3.3 目标DNA检测及验证其选择性23-25
- 2.3.4 DNA甲基化及甲基转移酶活性的检测25-26
- 2.3.5 化学试剂甲基化的检测26-27
- 2.3.6 在人血清中检测M.SssI甲基转移酶的活性27-28
- 2.4 本章小结28-29
- 第三章 基于限制性内切酶HpaⅡ和聚苯胺的无标记电化学检测甲基转移酶活性29-41
- 3.1 引言29-31
- 3.2 实验部分31-33
- 3.2.1 试剂和仪器31
- 3.2.2 捕获探针DNA修饰金电极的制备31-32
- 3.2.3 捕获DNA与目标DNA杂交32
- 3.2.4 DNA甲基化及限制性内切酶HpaⅡ和外切酶Ⅲ的作用32
- 3.2.5 HRP模拟酶和聚苯胺的形成32
- 3.2.6 抑制剂对M.SssI甲基转移酶活性的抑制32-33
- 3.2.7 电化学测试33
- 3.3 结果与讨论33-40
- 3.3.1 聚苯胺的电化学性能33-35
- 3.3.2 电化学检测M.SssI甲基转移酶活性35-38
- 3.3.3 在人血清中测定M.SssI甲基转移酶的活性38-39
- 3.3.4 不同浓度抑制剂对M.SssI甲基转移酶活性的抑制39-40
- 3.4 本章小结40-41
- 第四章 总结与展望41-42
- 参考文献42-52
- 致谢52-53
- 作者简介53
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本文编号：357255
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