猪流行性腹泻病毒（PEDV）流行株的序列分析和抗原表位表达

发布时间：2022-01-07 03:54

　　猪流行性腹泻（PED）是以水样腹泻、脱水和呕吐为临床症状的一种高接触性急性肠道传染病,病原为猪流行性腹泻病毒（PEDV）.猪流行性腹泻病毒和传染性胃肠炎病毒（TGEV）同属冠状病毒科（coronaviridae）冠状病毒属（coronavirus）的成员。PEDV可以诱使各种年龄段的猪发病,其中受它侵害最严重的是哺乳仔猪,可造成乳猪高达100%的发病率和死亡率。自2011年在我国暴发以来,该病已然成为世界流行性的疾病,是造成我国各地养殖场仔猪死亡的主要疫病之一,严重地危害养殖业的发展和养殖户的经济利益。因此,每年对PED的流行病学监测和免疫预防是一项必不可少的任务,特别是通过分子生物学手段对PEDV的分子流行病学特征进行监测,可使我们了解PEDV毒株的来源和变异程度及毒株之间的亲缘关系,从而为该病的防控提供理论依据。针对于此,本论文进行了如下内容的研究：（1）利用RT-PCR和分子克隆等分子生物学技术对地方流行毒株SDZB_CH2014进行了全基因测序,并使用CLUSTAL1.83和MAGE5软件将该序列与来自我国、美国、韩国、加拿大等国的64株参考毒株进行比较分析... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：66 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 综述
    1 PED的流行
        1.1 国外流行情况
        1.2 国内流行情况
    2 PEDV的形态结构
    3 PEDV的分类地位和分子特征
    4 PED的诊断
        4.1 RT-PCR法
        4.2 ELISA法
        4.3 免疫电镜法
        4.4 直接免疫荧光法
        4.5 微量血清中和试验
    5 PED的治疗
    6 PED的疫苗研究
        6.1 PED组织灭活苗
        6.2 PED细胞灭活苗
        6.3 PED弱毒苗
        6.4 转基因疫苗
            6.4.1 植物疫苗
            6.4.2 乳酸杆菌疫苗
    7 选题的目的及意义
第二章 一株PEDV流行毒株全基因组的序列分析
    1 材料与方法
        1.1 样品
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 引物设计
        1.5 总RNA提取
        1.6 获得目的片段的方法
        1.7 PEDV全基因的分析
        1.8 参考序列
        1.9 RT-PCR
            1.9.1 RT-PCR扩增体系
            1.9.2 RT-PCR扩增程序
        1.10 PCR产物鉴定及纯化回收
            1.10.1 PCR产物鉴定
            1.10.2 PCR产物的回收
        1.11 PCR产物连接与转化
            1.11.1 连接
            1.11.2 转化
        1.12 重组质粒提取、鉴定及序列测定
            1.12.1 筛选菌落
            1.12.2 碱裂解法提取质粒
            1.12.3 重组质粒的鉴定
            1.12.4 序列测定
    2 结果
        2.1 RT-PCR扩增结果
        2.2 PEDV流行毒株SDZB_CH2014与64株参考毒株系统发育关系
        2.3 S基因分析
            2.3.1 S基因抗原性分析
            2.3.2 S基因的B细胞线性表位分析
            2.3.3 S基因的系统发育树
        2.4 ORF3系统发育关系树
        2.5 E基因系统发育关系树
        2.6 M基因系统发育关系树
        2.7 N基因系统发育关系树
    3 讨论
第三章 2013-2014年PEDV地方流行毒株S基因的分析
    1 材料与方法
        1.1 样品
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 引物设计
        1.5 总RNA提取
        1.6 获得目的片段的方法
        1.7 S 基因的分析
        1.8 参考序列
        1.9 PEDV S基因RT-PCR
            1.9.1 RT-PCR扩增体系
            1.9.2 RT-PCR扩增程序
        1.10 PCR产物鉴定及纯化回收
        1.11 PCR产物连接与转化
        1.12 重组质粒提取、鉴定及序列测定
    2. 结果与分析
        2.1 S基因的RT-CR
        2.2 PEDV流行毒株S基因与参考毒株的系统发育关系树
            2.2.1. 序列确定
            2.2.2 PEDV S基因的系统发育树
            2.2.3 PEDV S基因与8株参考毒株同源性分析
    3 讨论
第四章 PEDV流行毒株和疫苗株S基因抗原表位表达
    1 材料和方法
        1.1 病毒、细胞、载体、感受态细胞
        1.2 主要试剂
        1.3 主要仪器设备
        1.4 融合试剂盒的选择
        1.5 引物的设计
        1.6 大肠杆菌原核表达载体和限制性内切酶的选择
        1.7 目的片段扩增引物和融合片段(S1P1-3)的鉴定引物
        1.8 目的片段扩增
        1.9 目的片段的融合和转化
            1.9.1 PCR产物电泳、回收
            1.9.2 目的片段的融合
            1.9.3 融合片段的转化
        1.10 重组质粒提取和鉴定
            1.10.1 筛选菌落
            1.10.2 碱裂解法提取质粒
            1.10.3 重组质粒的鉴定
        1.11 大肠杆菌原核表达载体pET32a(+)和含有融合片段的重组质粒PMD18-T的酶切、回收
            1.11.1 酶切
            1.11.2 回收
        1.12 表达载体pET32a(+)与融合片段S1P1-3的连接
        1.13 重组表达载体转入DH5 α感受态细胞
        1.14 重组表达载体转入原核表达菌BL21
        1.15 鉴定
        1.16 表达
            1.16.1 时间优化
            1.16.2 IPTG浓度优化
        1.17 SDS-PAGE
        1.18 Western BLot
            1.18.1 电泳分离
            1.18.2 转膜
            1.18.3 杂交与显色
    2 结果和分析
        2.1 S1基因3个片段的PCR扩增
        2.2 载体和融合片段的酶切
        2.3 重组质粒PCR鉴定
        2.4 SDS-PAGE
        2.5 Western-Blotting检测
    3 讨论
第五章 结论
参考文献
攻读硕士期间的主要科研成果
项目资助
致谢
附录


【参考文献】：
期刊论文
[1]新发猪流行性腹泻病毒ORF3基因的遗传进化分析[J]. 董世娟,朱于敏,于瑞嵩,司伏生,石明明,张源淑,李震.  华中农业大学学报. 2014(05)
[2]仔猪流行性腹泻的新特点与防控建议[J]. 杨汉春.  北方牧业. 2013(13)
[3]2011年福建省猪流行性腹泻的流行特点及其防治措施[J]. 张世忠,江斌.  福建畜牧兽医. 2012(02)
[4]猪流行性腹泻的防治[J]. 廖启富.  湖北畜牧兽医. 2012(03)
[5]国内猪流行性腹泻防治概况[J]. 徐国栋,李峰,张广峰.  畜牧与兽医. 2011(12)
[6]猪流行性腹泻的特点与防控[J]. 李中兴,毛雪红.  农村养殖技术. 2011(23)
[7]猪流行性腹泻流行特点及流行现状的研究[J]. 甘振磊,汤德元,李春燕,王彬,张晓杰,王凤,刘志杰.  猪业科学. 2010(12)
[8]猪流行性腹泻的实验室诊断方法[J]. 李思银,杨亮宇,杨玉艾.  猪业科学. 2010(12)
[9]猪流行性腹泻的实验室诊断方法研究进展[J]. 刘涛,王瑞.  猪业科学. 2010(12)
[10]表达猪流行性腹泻病毒中和抗原位点的重组干酪乳杆菌免疫小鼠诱导的免疫应答[J]. 葛俊伟,姜艳平,汪淼,乔薪瑗,刘敏,唐丽杰,李一经.  中国兽医科学. 2010(07)



本文编号：3573761