基于实时连接酶链式反应检测甲基转移酶和糖基化酶活性研究
发布时间：2022-01-17 09:05
DNA甲基转移酶和糖基化酶是生命体中重要的两种酶。这两种酶的异常表达均会引起DNA碱基变化,甚至导致肿瘤的发生。因此,开发简单、有效的检测甲基转移酶和糖基化酶活性的方法对疾病的诊断和疗效监测具有重要意义。本文基于实时连接酶链式反应（real-time LCR）分别建立了一种检测甲基转移酶和糖基化酶的新方法。具体内容如下:一、基于实时连接酶链式反应检测M.SssI甲基转移酶。我们设计了两条完全互补且中间含5’-CCGG-3’序列的长DNA链T1、T2。当存在M.SssI时,甲基化的长DNA链不会被HpaII识别并切割,它会作为LCR的模板引发LCR反应,荧光染料SYBR Green I嵌入LCR产物中荧光增强。反之无M.SssI甲基转移酶时,无法引发体系中的LCR反应。通过检测荧光强度的变化可实现该方法对M.SssI甲基转移酶活性的检测,线性范围为0.002 U/mL-0.1 U/mL,检出限为0.001 U/mL。该方法还可用于M.SssI抑制剂的筛选,并且适用于复杂的生物样品。我们建立的M.SssI甲基转移酶检测方法设计简单、操作简便、成本低,对于临床诊断和药物开发具有重要意义。二、...
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于热敏聚合物（N-异丙基丙烯酰胺）高灵敏荧光检测甲基转移酶原理[34]
河北大学硕士学位论文10杂交，形成带有缺口的DNA杂交体。在UDG的作用下，发夹环中的两个尿嘧啶碱基被去除，以生成两个AP位点。位于缺口3"侧的AP位点抑制了连接酶的连接，使发夹探针末端的两段序列仍然相邻。进一步打开H1，再打开H2，H2打开后暴露G4结构，CHA反应的进行，产生大量G4结构，可嵌入N-甲基-间卟啉IX（NMM）产生强的荧光信号。在UDG不存在时，连接酶将与发卡式探针互补的短核苷酸连接，不再与H1杂交，从而禁止CHA反应，不会有荧光信号。该方法在0.0005-0.02U/mL范围内实现了对UDG活性的检测，但是该方法的线性范围较窄。图1-6尿嘧啶去除抑制连接与催化发夹组装用于检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[48]。1.3.2切口酶依赖的链置换扩增切口酶依赖的链置换扩增（Stranddisplacementamplification，SDA）是通过限制性内切酶在dsDNA中一条链上形成缺口，无5"-3"核酸外切酶活性的DNA聚合酶从缺口处3"端进行延伸反应，同时将下游的旧链解离。限制性内切酶继续作用，新的缺口再次产生并进入下一轮循环。最后产生多条被置换出来的单链DNA（ssDNA）。Wang等人提出了基于切除修复引发的酶辅助双级联信号放大策略检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性的方法[49]。原理如图1-7所示，该实验涉及（1）UDG尿嘧啶切除修复，（2）切除修复引发的切口酶介导的链置换扩增，（3）核糖核酸酶H（RNaseH）诱导的信号探针水解产生荧光信号。在UDG的存在时，茎环DNA底物去除尿嘧啶产生一个AP位点。核酸内切酶IV（EndoIV）随后切割AP位点，切断DNA底物启动链置换扩增，产生大量的短链DNA（图中Trigger）。Trigger与另一模板杂交，再次发生切口酶介导的链置换反应，进一步生成更多Trigger。Trigger可与经FAM和BHQ1修饰的RNA信
第1章引言11号探针杂交，形成RNA-DNA双链体。RNaseH随后水解RNA-DNA双链体中的RNA释放Trigger，Trigger再次杂交水解信号探针，信号探针的不断水解，使荧光信号恢复，可实现对UDG的检测。但该方法需要聚合酶、限制性内切酶、RNaseH、FAM和BHQ1修饰的RNA信号探针，成本较高。图1-7基于切除修复引发的酶辅助双级联信号放大策略检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性的原理[49]。1.3.3滚环扩增滚环扩增（RollingCircleAmplification，RCA）是一种恒温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与环状模板互补），在酶催化作用下将dNTPs聚合为ssDNA，此ssDNA包含多个重复的模板互补片段。图1-8基于EndoIV辅助的滚环扩增荧光分析法检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[50]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA损伤修复与癌症[J]. 回天鹤. 临床医药文献电子杂志. 2017(79)
本文编号：3594455
【文章来源】：河北大学河北省
【文章页数】：57 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
基于热敏聚合物（N-异丙基丙烯酰胺）高灵敏荧光检测甲基转移酶原理[34]
河北大学硕士学位论文10杂交，形成带有缺口的DNA杂交体。在UDG的作用下，发夹环中的两个尿嘧啶碱基被去除，以生成两个AP位点。位于缺口3"侧的AP位点抑制了连接酶的连接，使发夹探针末端的两段序列仍然相邻。进一步打开H1，再打开H2，H2打开后暴露G4结构，CHA反应的进行，产生大量G4结构，可嵌入N-甲基-间卟啉IX（NMM）产生强的荧光信号。在UDG不存在时，连接酶将与发卡式探针互补的短核苷酸连接，不再与H1杂交，从而禁止CHA反应，不会有荧光信号。该方法在0.0005-0.02U/mL范围内实现了对UDG活性的检测，但是该方法的线性范围较窄。图1-6尿嘧啶去除抑制连接与催化发夹组装用于检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[48]。1.3.2切口酶依赖的链置换扩增切口酶依赖的链置换扩增（Stranddisplacementamplification，SDA）是通过限制性内切酶在dsDNA中一条链上形成缺口，无5"-3"核酸外切酶活性的DNA聚合酶从缺口处3"端进行延伸反应，同时将下游的旧链解离。限制性内切酶继续作用，新的缺口再次产生并进入下一轮循环。最后产生多条被置换出来的单链DNA（ssDNA）。Wang等人提出了基于切除修复引发的酶辅助双级联信号放大策略检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性的方法[49]。原理如图1-7所示，该实验涉及（1）UDG尿嘧啶切除修复，（2）切除修复引发的切口酶介导的链置换扩增，（3）核糖核酸酶H（RNaseH）诱导的信号探针水解产生荧光信号。在UDG的存在时，茎环DNA底物去除尿嘧啶产生一个AP位点。核酸内切酶IV（EndoIV）随后切割AP位点，切断DNA底物启动链置换扩增，产生大量的短链DNA（图中Trigger）。Trigger与另一模板杂交，再次发生切口酶介导的链置换反应，进一步生成更多Trigger。Trigger可与经FAM和BHQ1修饰的RNA信
第1章引言11号探针杂交，形成RNA-DNA双链体。RNaseH随后水解RNA-DNA双链体中的RNA释放Trigger，Trigger再次杂交水解信号探针，信号探针的不断水解，使荧光信号恢复，可实现对UDG的检测。但该方法需要聚合酶、限制性内切酶、RNaseH、FAM和BHQ1修饰的RNA信号探针，成本较高。图1-7基于切除修复引发的酶辅助双级联信号放大策略检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性的原理[49]。1.3.3滚环扩增滚环扩增（RollingCircleAmplification，RCA）是一种恒温核酸扩增方法，以环状DNA为模板，通过一个短的DNA引物（与环状模板互补），在酶催化作用下将dNTPs聚合为ssDNA，此ssDNA包含多个重复的模板互补片段。图1-8基于EndoIV辅助的滚环扩增荧光分析法检测尿嘧啶DNA糖基化酶活性原理[50]。
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA损伤修复与癌症[J]. 回天鹤. 临床医药文献电子杂志. 2017(79)
本文编号：3594455
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