植物淀粉合成酶基因的复制和功能分化研究

发布时间：2017-05-15 11:05

  本文关键词：植物淀粉合成酶基因的复制和功能分化研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：淀粉是植物光合作用的产物,主要贮藏于作物籽粒里,是人类膳食和动物饲料的重要能量来源,同时也被广泛应用于造纸、制药等行业,是重要的工业原料。目前植物淀粉的生物合成过程已基本清楚,涉及的关键酶及其编码基因已在遗传和生化方面开展了大量研究,明确了其生理功能。为深入研究植物淀粉合成代谢的分子机制,揭示不同进化等级植物具有不同淀粉合成能力的可能分子进化基础,本研究以植物淀粉生物合成代谢网络中的淀粉合成酶基因家族为研究对象,结合分子生物学和生物信息学方法,分离鉴定了植物淀粉合成酶家族的新基因,淀粉合成酶V (SSV),还选取了在不同进化等级上具有代表性的,且全基因组序列已被测定的植物为材料,解析淀粉合成酶家族基因的复制方式、不同亚家族的序列变化,及其进化选择压力与功能分化。主要的研究结果如下：1.在玉米自交系18-599中,克隆了ZmSSV的全长CDS (GenBankaccession number: KP192927);并以ZmSSV的CDS序列为查询序列,用BLASTn程序搜索高粱基因组序列,鉴定并克隆了SbSSV的全长CDS (GenBank accession number:KP 192926)。此外,还通过基因组搜索等,鉴定了藻类、苔藓、卷柏和一些双、单子叶植物的SSV。推导的SSV蛋白均具有植物淀粉合成酶家族特有的保守结构域,系统进化分析表明SSV与已知的SSIV亲缘关系最近,由一个祖先基因复制产生。因此推测本研究鉴定的SSV为植物淀粉合成酶家族的新亚型。2.采用Real-Time PCR分析了ZmSSV和SbSSV的表达特性。结果表明,ZmSSV主要在叶片和灌浆期的籽粒里表达,随着籽粒灌浆的推进,其表达逐渐增强,授粉后15天的籽粒表达量高于10天。SbSSV在叶片中的表达量远高于根和茎,且该基因在叶片中的表达受光诱导,具有昼夜节律特性。因此SSV的表达特性与其他淀粉合成酶类似,推测该基因可能在淀粉合成过程中起着重要作用。3.以单子叶、双子叶、蕨类,苔藓和藻类等的代表性植物为对象,深入分析系SS基因家族的分子进化特征,发现SS包含两类不同进化起源的基因,分为6个亚家族。一类为GBSS、SSISSII,另一类为SSⅢ、SSIV和SSV。这些亚家族存在于从藻类到单子叶的所有植物中,是祖先基因在植物形成早期经基因复制产生的,在后续进化中发生了功能分化。4.SS各个亚家族基因,在不同植物中发生的复制次数和丢失情况不同,导致这些基因在不同植物里的拷贝数不同。总体来说,高等植物,尤其在禾本科作物里,基因复制次数多,拷贝数增多。复制基因功能分化后,产生了作物胚乳淀粉合成代谢途径,可以大量、高效地合成具有不同结构的贮藏淀粉。分析结果还显示,植物SS的复制方式主要是染色体大片段复制或全基因组复制。5.SS家族的基因结构相对保守,总体来说,高等植物的外显子和内含子数量多于低等植物,基因结构更复杂,推测这些基因在高等植物里,可能存在基于内含子的更复杂和精细的表达调控。6.SS家族C-端高度保守,包含GT-5和GT-1两个特征结构域。各亚家族的N端序列差异大,每个亚家族都具有其特异的保守基序,推测这些基序可能与酶的底物特异性相关。此外,分析每个亚家族内部,不同进化等级植物的SS蛋白间也存在差异基序,推测这些基序可能与淀粉合成量和合成能力相关。7.SS基因复制后,部分氨基酸位点受到正选择,导致不同氨基酸位点进化速率的改变,促使复制基因产生功能分化。但95%以上的位点仍主要受中性选择和纯化选择,表明SS基因在进化过程中相对保守。不同进化等级的植物合成淀粉的类型,质量,结构和用途有差异,可能的分子进化机制是在高等植物中,尤其是在禾本科植物中,SS基因发生了特定的复制,并在随后的进化中保留下来,形成了胚乳淀粉代谢途径,具有了精细的表达调控,同时形成了特定的保守结构域,且其部分氨基酸位点受到正选择,从而促进了高等植物高效合成淀粉的能力。
【关键词】：淀粉合成酶 SSV 基因复制 功能分化 正选择
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：Q943.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 缩写表9-12
• 1 文献综述12-24
• 1.1 淀粉生物合成12-19
• 1.1.1 淀粉的基本结构12-13
• 1.1.2 淀粉生物合成相关的酶13-19
• 1.1.2.1 ADP-葡萄糖焦磷酸化梅(ADP-Glc pyrophosphorylase,AGPase)15-16
• 1.1.2.2 淀粉合成酶(starch synthase,SS)16-17
• 1.1.2.3 淀粉分支酶(starch branching enzyme,SBE)17-18
• 1.1.2.4 淀粉去分支酶(de-branching enzyme,DBE)18-19
• 1.1.2.5 淀粉磷酸化酶(Starch phosphorylase,SP)19
• 1.2 基因复制机制与功能分化19-23
• 1.2.1 基因复制的机制20-21
• 1.2.1.1 串联复制(tandem duplication)20
• 1.2.1.2 片段复制(Segment duplication)20
• 1.2.1.3 逆转录转座(Retrotransposition)20-21
• 1.2.1.4 全基因组复制(Whole genome duplication)21
• 1.2.2 复制基因的分化命运21-23
• 1.2.2.1 无功能化(Nonfunctionalization)22
• 1.2.2.2 新功能化(Neofunctionalization)22
• 1.2.2.3 亚功能化(Subfunctionalization)22-23
• 1.3 基因进化选择与功能分化的研究方法23-24
• 1.4 淀粉合成酶基因的倍增及进化研究进展24
• 2 本研究的目的和意义24-25
• 3 材料与方法25-32
• 3.1 淀粉合成酶V新基因的鉴定25-29
• 3.1.1 实验材料25-26
• 3.1.2 实验试剂26
• 3.1.3 总RNA的提取26-27
• 3.1.4 cDNA第一链的合成27
• 3.1.5 RT-PCR扩增ZmSSV和SbSSV基因27-28
• 3.1.6 Real-Time PCR分析SSV的表达特性28-29
• 3.2 SS基因家族的分子进化分析29-32
• 3.2.1 序列收集29-30
• 3.2.2 系统发育树的构建30
• 3.2.3 基因结构分析30
• 3.2.4 蛋白结构域与保守基序分析30-31
• 3.2.5 进化选择压力分析31-32
• 3.2.6 功能分化分析32
• 4 结果与分析32-48
• 4.1 SSV新基因的鉴定32-39
• 4.1.1 总RNA的提取32-33
• 4.1.2 RT-PCR扩增SSV全长CDS33-36
• 4.1.3 SSV的表达分析36-39
• 4.1.3.1 标准曲线的建立36-37
• 4.1.3.2 SSV基因时空特异性表达37-39
• 4.2 淀粉合成酶基因家族的分子进化分析39-48
• 4.2.1 序列收集39
• 4.2.2 系统发育树的构建39-41
• 4.2.3 SS家族的结构41-43
• 4.2.4 SS基因蛋白结构域和保守基序分析43-46
• 4.2.5 SS基因的进化选择压力分析46-48
• 4.2.6 基因的功能分化分析48
• 5 讨论48-53
• 5.1 RNA提取48-49
• 5.2 SSV基因的时空表达特性49-50
• 5.3 SS基因家族的起源和进化50-51
• 5.4 SS基因家族的保守基序51-52
• 5.5 SS基因家族的复制及功能分化机制52-53
• 6 结论53-54
• 参考文献54-63
• 致谢63-64
• 发表文章情况64-65
• 附录65-77

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